蛋白質活性再生における添加剤効果の解明と汎用的蛋白質調製系の構築

阐明添加剂对蛋白质活性再生的影响并构建通用蛋白质制备系统

基本信息

批准号：
16760628
负责人：
梅津光央
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16760628/
关键词：
不溶性顆粒大腸菌発現巻き戻しアルギニン

项目摘要

現在、簡便で安定的な蛋白質大量調製系の構築が求められているが、最も汎用性の高い大腸菌発現系では発現した蛋白質が不活性な不溶性顆粒として沈殿してしまうことが多々ある。これまで申請者は、バイオ医薬の中心的な役割を果たしている抗体蛋白質について、実際の不溶性顆粒から高効率で巻き戻すシステム(添加剤導入段階透析法)を開発してきた。この手法は、不溶性顆粒を高濃度の変性剤で可溶化後、変性剤を段階的に除去し、最適な段階で凝集抑制剤や酸化還元剤を添加することを基本としており、様々な抗体や受容体の蛋白質で80%以上の活性再生効率を達成している。この添加剤導入段階透析法は、透析速度の制御や酸化還元剤・凝集抑制剤の添加法を改良することによって、多種多様な蛋白質の巻き戻り特性に対応できる利点がある。昨年度では、最も基本的なスーパーフォールド構造(9種類)骨格を持つ蛋白質に対して、添加剤導入段階透析法を適応させた。そこで今年度は、単量体ではなく、多量体を形成する蛋白質への添加剤導入段階透析法を行い、多量体を形成して機能している蛋白質の巻き戻しにおいて、ドメイン間の不適切な相互作用を抑制する添加剤導入を試みた。その結果、ドメイン間の相互作用は、基本的に蛋白質表面の疎水的領域の増加と共に影響が顕著に現れることがわかった。そして、適切な二次構造を形成するまえに、ドメイン間の相互作用が大きすぎると蛋白質は凝集する方向へ進むことがわかった。その結果、CDシグナルが二次構造を示し、トリプトファン蛍光がブルーシフトする段階でアルギニンを添加することが効果的であることがわかった。

目前，需要构建简单、稳定的大规模蛋白质制备系统，但在最通用的大肠杆菌表达系统中，表达的蛋白质常常沉淀为无活性、不溶性颗粒。迄今为止，申请人已经开发了一种用于从实际的不溶性颗粒中高效解旋在生物制药中发挥核心作用的抗体蛋白的系统（添加剂引入阶段透析方法）。该方法基于用高浓度变性剂溶解不溶性颗粒，然后分阶段去除变性剂，并在最佳阶段添加聚集抑制剂或氧化还原剂，受体的活性再生效率超过80%。蛋白质。这种添加剂引入步骤透析方法的优点是通过控制透析速率和改进添加氧化还原剂和聚集抑制剂的方法能够适应多种蛋白质的解旋特性。去年，我们将添加引入步骤透析方法应用于具有最基本的超折叠结构（九种类型）的蛋白质。因此，今年，我们将进行在形成多聚体的蛋白质中引入添加剂的透析方法，并且我们将在形成多聚体的蛋白质中引入添加剂的透析方法进行了尝试。抑制相互作用的添加剂。结果发现，随着蛋白质表面疏水区域的增加，结构域之间的相互作用变得更加明显。他们发现，如果结构域之间的相互作用太大，蛋白质就会在形成适当的二级结构之前聚集。结果发现，在CD信号显示二级结构并且色氨酸荧光移至蓝色的阶段添加精氨酸是有效的。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Nondenaturing solubilization of β2 microglobulin from inclusion bodies by L-arginine

L-精氨酸对包涵体中 β2 微球蛋白的非变性溶解

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
0
作者：
Umetsu et al.
通讯作者：
Umetsu et al.

Bioassisted room-temperature immobilization and mineralization of Zinc Oxide-High order structuration of ZnO nanoparticles to a flower-type morphology -

氧化锌的生物辅助室温固定化和矿化-ZnO纳米颗粒的高阶结构至花型形态-

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
0
作者：
Umetsu et al.
通讯作者：
Umetsu et al.

SUPERCRITICAL WATER TREATMENT OF BIOMASS FOR ENERGY AND MATERIAL RECOVERY

用于能源和材料回收的生物质超临界水处理

DOI：
10.1080/00102200500290815
发表时间：
2006-01-01
期刊：
Combustion Science and Technology
影响因子：
1.9
作者：
Y. Matsumura;M. Sasaki;Kazuhide S. Okuda;S. Takami;S. Ohara;M. Umetsu;T. Adschiri
通讯作者：
T. Adschiri

Selective Detection of the Solid-state NMR Signals from the Bacteriochlorophyll a Dimers in a Reconstituted Light-harvesting 1 Complex

选择性检测重组光捕获 1 复合物中细菌叶绿素 a 二聚体的固态 NMR 信号