蛋白質の大量発現で形成される封入体の固体核磁気共鳴法による構造解析

使用固态核磁共振对大规模蛋白质表达形成的包涵体进行结构分析

基本信息

批准号：
14780502
负责人：
梅津光央
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780502/
关键词：
封入体蛋白質発現蛋白質巻き戻し固体NMR 蛋白質可溶化

项目摘要

昨年度は、ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)を特異的に認識する抗体HyHEL10の一本鎖Fv断片(HyHEL10-scFv)が形成する封入体の構造解析を中心に行ってきたが、今年度は超好熱古細菌Pyrococcus horikohii OT3由来蛋白質の大腸菌発現で得られる封入体の構造解析とその構造を利用した巻き戻し法の開発を行った。まず、超耐熱性蛋白質が形成する不溶性顆粒のFT-IRスペクトルを測定したところ、他のものとは異なり非常に天然型構造と類似した二次構造を形成していることがわかった。さらに、二次元固体NMR法からValやAlaのCβ・Cγ化学シフト値を求めたところ、天然型と類似したαヘリックスの存在も確認され、超耐熱性蛋白質の二次構造は大腸菌内の発現で非常に速い時期に二次構造が形成されていることが示唆された(梅津他,FEBS Letters 557,49-56(2004))。次に、超耐熱性蛋白質に関して、不溶性顆粒中の構造を考慮した蛋白質再活性を試みたた。まず、不溶性顆粒の構造を変性させないで可溶化する方法として低濃度のカオトロピック剤を用いた。その結果、2Mグアニジン溶液で目的蛋白質は構造を保ちながら可溶化することがわかった。そして、そこから、アルギニン溶液を介してグアニジンを透析により除去していくと、高効率で蛋白質は天然型へ巻き戻り、耐熱性を示した。さらに、この手法を緑色蛍光蛋白質にも応用したところ、2Mグアニジン溶液ではなく2Mアルギニン溶液を用いることによって、天然型と同じ活性を持つ巻き戻りタンパク質が速やかに形成された。(津本,梅津他,Biochemical Biophysical Research Communications 312,1383-1386(2003))。以上から、不溶性顆粒中でも発現蛋白質はある程度天然型構造を形成しており、その構造を利用した蛋白質再活性法は十分可能であり、従来の手法よりも非常に簡便になることを示すことができた。

去年，我们重点分析了特异性识别鸡蛋清溶菌酶（HEL）的抗体 HyHEL10 的单链 Fv 片段（HyHEL10-scFv）形成的包涵体的结构，但今年，我们分析了通过在大肠杆菌中表达来自古菌Pyrococcus horikohii OT3的蛋白质而获得包涵体，并开发了利用该结构的解旋方法。首先，我们测量了超热稳定蛋白形成的不溶性颗粒的红外光谱，发现与其他颗粒不同，它们形成了与天然结构非常相似的二级结构。此外，当使用二维固态NMR方法测定Val和Ala的Cβ和Cγ化学位移值时，也证实了与天然类型类似的α-螺旋的存在，并且其二级结构通过在大肠杆菌中的表达来测定超热稳定的蛋白质，表明二级结构形成得非常快（Umezu 等人，FEBS Letters 557, 49-56 (2004)）。接下来，我们尝试通过考虑不溶性颗粒的结构来重新激活超热稳定性蛋白质。首先，使用低浓度的离液剂来溶解不溶性颗粒而不改变其结构。结果发现，目标蛋白溶解在2M胍溶液中，同时保持其结构。然后，当通过精氨酸溶液透析去除胍时，蛋白质高效地重新卷回其天然形式并表现出耐热性。此外，当将该方法应用于绿色荧光蛋白时，通过使用2M精氨酸溶液代替2M胍溶液，快速形成与天然类型具有相同活性的解绕蛋白。 (Tsumoto, Umezu 等人，Biochemical Biophysical Research Communications 312, 1383-1386 (2003))。由上可知，表达的蛋白质即使在不溶性颗粒中也能在一定程度上形成天然结构，并且利用该结构的蛋白质再活化方法是完全可行的并且比常规方法简单得多。