発光イメージングを利用したDNA修復経路の破綻による神経症状発症機構の解明

利用发光成像阐明 DNA 修复途径破坏引起的神经系统症状的机制

• 批准号: 11J02843
• 负责人: 落合 博
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02843/
• 关键词: TALEN; 放射線; ゲノム不安定性; 小頭症; zinc-finger nucleases

胎内で放射線を被爆することで,高頻度に小頭症を発症することが知られている。また放射線はDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し,DSB修復機構やゲノム安定性の維持に先天的な異常を持つ患者の多くにおいて小頭症が認められることから,DSB修復機構やゲノム安定性の維持と小頭症には密接な関係があると考えられる。しかし,疾患モデル神経幹細胞が樹立されておらず小頭症の発症メカニズムは明らかになっていない。昨年度に、人工ヌクレアーゼzinc-finger nuclease (ZFN)を利用してヒト培養細胞に小頭症の原因遺伝子領域へ外来遺伝子の導入を試みたが,効率が低く,両対立遺伝子に導入した細胞株を樹立することができなかった。本年度では,ZFNよりも結合特異性が高いとされる人工ヌクレアーゼtranscription activator-like effector nuclease (TALEN)を利用したゲノム編集技術の利用を検討した。まず,機能的なTALENを作製するために,ポリメラーゼ連鎖反応を利用した簡便なTALEN作製システムを確立した。このシステムを利用して,小頭症原因遺伝子の一つであるBUB1B遺伝子領域に標的を持つTALENを作製した。このTALEN発現ベクターとターゲティングベクターをヒト直腸結腸癌細胞HCT116に共導入し,薬剤選抜を行った。その結果,覧得られたクローンのほぼすべてが少なくとも片アレルに外来遺伝子の挿入が確認され,さらに約1/20のクローンで両アレルに外来遺伝子の挿入が認められた。このことから,TALENを利用することで,ヒト培養細胞において高効率で特定遺伝子領域に外来遺伝子を挿入することができることがわかった。今後この技術を利用し,小頭症発症に関係する遺伝子を破壊したヒト疾患モデル神経幹細胞の作製が期待できる。

众所周知，子宫内暴露于辐射经常会导致小头畸形。此外，辐射还会引起DNA双链断裂（DSB），许多DSB修复机制和基因组稳定性存在先天性异常的患者会出现小头畸形，人们认为性保存与小头畸形之间存在密切关系。然而，神经干细胞疾病模型尚未建立，小头畸形发生的机制仍不清楚。去年，我们尝试使用人工核酸酶锌指核酸酶（ZFN）将外源基因引入培养的人类细胞中导致小头畸形的基因区域，但效率较低，而且我们无法使用同时含有两个等位基因的细胞系。无法成立。今年，我们研究了使用人工核酸酶类转录激活因子效应核酸酶（TALEN）的基因组编辑技术的使用，据说该技术比 ZFN 具有更高的结合特异性。首先，为了生产功能性TALEN，我们利用聚合酶链反应建立了一个简单的TALEN生产系统。利用这个系统，我们创建了一个针对 BUB1B 基因区域的 TALEN，BUB1B 基因区域是导致小头畸形的基因之一。将此TALEN表达载体和靶向载体共转染人结直肠癌细胞HCT116，并进行药物筛选。结果证实，几乎所有发现的克隆都至少在一个等位基因中插入了外源基因，大约1/20的克隆在两个等位基因中都插入了外源基因。这些结果表明，通过使用TALEN，外源基因可以高效地插入到培养的人类细胞的特定基因区域中。未来，希望这项技术能够用于创建人类疾病模型神经干细胞，其中与小头畸形发展相关的基因被破坏。

项目成果

TALE nuclease(TALEN)を用いた培養細胞におけるゲノム編集

使用 TALE 核酸酶 (TALEN) 对培养细胞进行基因组编辑

• 发表时间: 2013
• 期刊: 実験医学
• 作者: 落合博;佐久間哲史;松浦伸也;山本卓
• 通讯作者: 山本卓

Equarin is involved as an FGF signaling modulator in chick lens differ entiation.

Equarin 作为 FGF 信号调节剂参与小鸡晶状体分化。

• DOI: 10.1016/j.ydbio.2012.05.029
• 发表时间: 2012
• 期刊: Developmenta Biology
• 作者: Song X;Sato Y;Felemban A;Ito A;Hossain M;Ochiai H;Yamamoto T;Sekiguchi K;Tanaka H;Ohta K.
• 通讯作者: Ohta K.

人工ヌクレアーゼを利用した遺伝子間領域に存在する 塩基変異導入によるヒト疾患モデル細胞の樹立

使用人工核酸酶在基因间区域引入碱基突变建立人类疾病模型细胞

• 发表时间: 2012
• 作者: 落合博;宮本達雄;金井昭教;細羽康介;佐久間哲史;野地澄晴;山本卓;松浦伸也
• 通讯作者: 松浦伸也

Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.

• DOI: 10.1038/ncomms2020
• 发表时间: 2012
• 期刊: Nature communications
• 影响因子: 16.6

HpSumf1 is involved in the activation of sulfatases responsible for regulation of skeletogenesis during sea urchin development

HpSumf1 参与硫酸酯酶的激活，负责海胆发育过程中骨骼形成的调节

• DOI: 10.1007/s00427-011-0368-2
• 发表时间: 2011
• 期刊: Development Genes and Evolution
• 影响因子: 2.4
• 作者: 佐久間哲史;大西和也;藤田和将;落合博;坂本尚昭;山本卓
• 通讯作者: 山本卓