発光イメージングを利用したDNA修復経路の破綻による神経症状発症機構の解明

利用发光成像阐明 DNA 修复途径破坏引起的神经系统症状的机制

基本信息

批准号：
11J02843
负责人：
落合博
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02843/
关键词：
TALEN 放射線ゲノム不安定性小頭症 zinc-finger nucleases

项目摘要

胎内で放射線を被爆することで,高頻度に小頭症を発症することが知られている。また放射線はDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し,DSB修復機構やゲノム安定性の維持に先天的な異常を持つ患者の多くにおいて小頭症が認められることから,DSB修復機構やゲノム安定性の維持と小頭症には密接な関係があると考えられる。しかし,疾患モデル神経幹細胞が樹立されておらず小頭症の発症メカニズムは明らかになっていない。昨年度に、人工ヌクレアーゼzinc-finger nuclease (ZFN)を利用してヒト培養細胞に小頭症の原因遺伝子領域へ外来遺伝子の導入を試みたが,効率が低く,両対立遺伝子に導入した細胞株を樹立することができなかった。本年度では,ZFNよりも結合特異性が高いとされる人工ヌクレアーゼtranscription activator-like effector nuclease (TALEN)を利用したゲノム編集技術の利用を検討した。まず,機能的なTALENを作製するために,ポリメラーゼ連鎖反応を利用した簡便なTALEN作製システムを確立した。このシステムを利用して,小頭症原因遺伝子の一つであるBUB1B遺伝子領域に標的を持つTALENを作製した。このTALEN発現ベクターとターゲティングベクターをヒト直腸結腸癌細胞HCT116に共導入し,薬剤選抜を行った。その結果,覧得られたクローンのほぼすべてが少なくとも片アレルに外来遺伝子の挿入が確認され,さらに約1/20のクローンで両アレルに外来遺伝子の挿入が認められた。このことから,TALENを利用することで,ヒト培養細胞において高効率で特定遺伝子領域に外来遺伝子を挿入することができることがわかった。今後この技術を利用し,小頭症発症に関係する遺伝子を破壊したヒト疾患モデル神経幹細胞の作製が期待できる。

众所周知，子宫辐射的暴露会导致小头畸形经常发育。此外，在维持DSB修复机制和基因组稳定性方面，辐射诱导DNA双链断裂（DSB），并且在许多先天性异常的患者中观察到小头畸形，并且人们认为DSB修复机制和基因组稳定性的维持之间存在密切的关系。但是，尚未建立疾病模型的神经干细胞，并且已经揭示了小头畸形发育的机制。去年，我们试图使用人造核酸酶锌指核酸酶（ZFN）将外来基因引入人类培养细胞中的小头畸形基因区域，但效率很低，并且引入两个等位基因的细胞系都无法建立。在今年，我们研究了使用人工核酸酶转录激活剂样效应核酸酶（TALEN）的基因组编辑技术的使用，据说它具有比ZFN更高的结合特异性。首先，建立了使用聚合酶链反应的简单Talen生产系统，以创建功能性TALEN。使用该系统，创建了Bub1b基因区域中具有靶标的靶标的TALEN，这是一个小头畸形引起基因的一种。该Talen表达载体和靶向载体被共同引入人类直肠结肠癌细胞HCT116，并进行了药物选择。结果，几乎所有发现的克隆都被证实将外国基因插入至少一个等位基因，在大约1/20的克隆中，观察到外源基因将外源基因插入两个等位基因。这表明，通过使用talen，可以将外源基因插入人类培养细胞中具有高效率的特定基因区域。该技术将来可以用于产生人类疾病的神经干细胞，这些神经干细胞破坏了与小头畸形发育有关的基因。

项目成果

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专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

TALE nuclease(TALEN)を用いた培養細胞におけるゲノム編集

使用 TALE 核酸酶 (TALEN) 对培养细胞进行基因组编辑

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
実験医学
影响因子：
0
作者：
落合博;佐久間哲史;松浦伸也;山本卓
通讯作者：
山本卓

Equarin is involved as an FGF signaling modulator in chick lens differ entiation.

Equarin 作为 FGF 信号调节剂参与小鸡晶状体分化。

DOI：
10.1016/j.ydbio.2012.05.029
发表时间：
2012
期刊：
Developmenta Biology
影响因子：
0
作者：
Song X;Sato Y;Felemban A;Ito A;Hossain M;Ochiai H;Yamamoto T;Sekiguchi K;Tanaka H;Ohta K.
通讯作者：
Ohta K.

人工ヌクレアーゼを利用した遺伝子間領域に存在する塩基変異導入によるヒト疾患モデル細胞の樹立

使用人工核酸酶在基因间区域引入碱基突变建立人类疾病模型细胞