多細胞生物における細胞間の遺伝子発現のゆらぎとその制御に関する研究

多细胞生物细胞间基因表达波动及其调控研究

基本信息

批准号：
09J01990
负责人：
落合博
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度では,ウニ胚においてzinc-finger nuclease (ZFN)を利用した標的遺伝子座へのレポーター遺伝子挿入技術を確立し,内在遺伝子の発現を定量化することで,多細胞生物の発生過程における遺伝子発現のゆらぎに関する知見を得ることを目的として以下の通り研究を実施した。ZFNはDNA結合ドメインとヌクレーゼドメインからなる人工タンパク質で,任意のDNA塩基配列領域へDNA二重鎖切断(DSB)を導入できる。DSBは細胞内で速やかに修復されるが,外来のターゲティングベクターとDSB周辺領域で相同組換え修復が起こることで,レポーター遺伝子が特定遺伝子座へ効率的に導入されることが知られている。まずウニ胚で標的遺伝子座へのレポーター遺伝子挿入が可能かどうかを確かめるために,昨年度に確立したZFN作製技術を利用して,ウニEts遺伝子のストップコドン直前を標的とするZFNを作製した。Ets ZFN mRNAと,2A-H2B-GFP遺伝子とその両端に約1kbpのEts遺伝子座と相同な配列を含んだターゲティングドナー構築をウニ胚に導入したところ,ゲノミックPCRでEts遺伝子座へのレポーター遺伝子挿入が確認され,また蛍光顕微鏡観察からEts発現細胞のみでGFPが発現していることがわかった。これらのことから,Ets遺伝子座に挿入されたレポーター遺伝子は内在遺伝子プロモーターによって発現が調節され,GFP蛍光強度はEts遺伝子の発現量を反映することが示唆された。経時的な遺伝子発現動態を解析するために,Ets ZFN mRNAとターゲティングドナー構築を共導入した胚を共焦点レーザー顕微鏡で経時的に観察した。その結果,1個体内の細胞間で遺伝子発現動態のばらつきが認められた。このことから,ウニの発生過程において恥遺伝子の発現は細胞間でゆらいでいることが示唆された。

今年，我们建立了利用锌指核酸酶（ZFN）在海胆胚胎中将报告基因插入目标位点的技术，通过量化内源基因的表达，我们将研究多细胞生物发育过程中的基因表达进行以下研究的目的是获得有关波动的知识。 ZFN是一种由DNA结合域和核酸酶域组成的人工蛋白质，可以将DNA双链断裂（DSB）引入任意DNA碱基序列区域。 DSB 在细胞内快速修复，已知通过外源靶向载体与 DSB 周围区域之间的同源重组修复，可以将报告基因有效导入特定位点。首先，为了确认是否可以在海胆胚胎的目标位点插入报告基因，我们利用去年建立的ZFN生产技术，制造了一个针对海胆Ets基因终止密码子之前的ZFN 。当含有 Ets ZFN mRNA、2A-H2B-GFP 基因和两端与 Ets 基因座同源的约 1 kbp 序列的靶向供体构建体导入海胆胚胎时，基因组将报告基因插入到 Ets 基因座中。 PCR 得到证实，荧光显微镜显示 GFP 仅在表达 Ets 的细胞中表达。这些结果表明插入Ets基因位点的报告基因的表达受到内源基因启动子的调控，并且GFP荧光强度反映了Ets基因的表达水平。为了分析随时间变化的基因表达动态，使用共聚焦激光显微镜观察了与 Ets ZFN mRNA 共转染和靶向供体构建体随时间变化的胚胎。结果，在一个个体的细胞之间观察到基因表达动态的变化。这表明在海胆的发育过程中，羞耻基因的表达在细胞间存在波动。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Targeted mutagenesis in the sea urchin embryo using Zinc-finger nucleses

使用锌指核对海胆胚胎进行定向诱变

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
落合博;藤田和将;鈴木賢一;西川正俊;柴田達夫;坂本尚昭;山本卓
通讯作者：
山本卓

Role of the nanos homolog druing sea urchin development

纳米同系物在海胆发育中的作用

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
Developmental Dynamics 238
影响因子：
0
作者：
藤井孝吉、坂本尚昭、落合博;他5名
通讯作者：
他5名

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DOI：
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
0
作者：
高見知秀;上脇隼一;落合博;小山真人;小川佳英;斉藤美佳子;松岡英明;楯真一
通讯作者：
楯真一

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发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
松浦伸也

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DOI：
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
0
作者：
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通讯作者：
大森博雄・小倉紀雄・石川忠男・畑明郎・西村肇・佐々木克之・谷田一三・小林哲・東信行・岩槻幸雄・山西良平・江崎保男・竹垣毅・尾崎清明・渡辺国広・竹村公太郎・岡野真久・松田芳夫・清野聡子・篠原修ほか５名