紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋白MerRの金属錯体における金属種区別法の解明

使用紫外共振拉曼光谱阐明 DNA 结合蛋白 MerR 金属复合物中金属种类的分化

基本信息

批准号：
03F00100
负责人：
北川禎三
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00100/
关键词：
紫外共鳴ラマン p53 ガン抑制因子共鳴ラマン

项目摘要

本課題の研究対象であるDNA結合蛋白のなかで、まずMerRの単離精製を試みたがうまくいかなかったので、第2候補の亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた.p53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積することから、この蛋白質が正常に機能していることで腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられている。p53に関しては細胞レベルで多くの研究が行われているが、分子レベルでその機能を明らかにした研究は今のところない。そこで本課題ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用い、分子レベルで明らかにする。American Type Culture Collectionより入手したヒトのp53のcDNAからDNA結合ドメインをPCRで増幅し、発現ベクターに組み込み、大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳は3つのヌクレオチドからなるコドンを介して行われるが、真核生物と原核生物では同じアミノ酸でも好んで使用されるコドンが異なるため、真核生物の蛋白質を原核生物である大腸菌で発現させる場合、発現効率が悪いことがある。ヒト由来のp53を用いた本研究でも、発現量が極めて低く、初めは培地1Lあたり0.2mg程度の精製蛋白質しか得られなかった。そこで最適な大腸菌種の選択や発現条件の最適化を行うことで、当初の10倍以上である10mg/培地1L程度の収量が得られるようになった。精製蛋白質は金属を含まないアポ蛋白質だったので、ZnやCu,Niで再構成した。アポ蛋白質の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定したところ1478cm^<-1>にトリプトファン由来と思われる強いバンドが観測されたが、Niを再構成した蛋白質では、1398cm^<-1>にシフトしていた。現段階ではまだ詳細を議論できる程の良質なスペクトルが得られていないので、今後は更に蛋白質の精製量を増やし、スペクトルを測定すると共に、変異体を作製し、p53の情報伝達メカニズムを明らかにしていく予定である。

在本项目的研究目标DNA结合蛋白中，我们首先尝试分离和纯化MerR，但没有成功，因此我们将重点放在第二个候选蛋白上，即锌敏感的p53蛋白，被称为癌症抑制蛋白。，一种参与DNA复制、细胞生长、细胞分裂等的蛋白质。由于许多p53突变体在癌细胞中积累，因此人们认为这种蛋白质的正常功能可以抑制肿瘤和癌症的生长。尽管在细胞水平上对p53进行了大量研究，但迄今为止还没有研究在分子水平上阐明其功能。因此，在本项目中，我们将利用紫外共振拉曼光谱在分子水平上阐明p53的信息传递机制。通过PCR从美国典型培养物保藏中心获得的人p53 cDNA中扩增DNA结合结构域，并将其整合到表达载体中以构建大肠杆菌中的表达系统。 DNA翻译成蛋白质是通过由三个核苷酸组成的密码子进行的，但由于真核生物和原核生物对相同的氨基酸偏好不同的密码子，因此真核蛋白质可以翻译成原核蛋白质，在大肠杆菌中表达时，表达效率可能会提高。贫穷。即使在这项使用人源p53的研究中，表达水平也极低，最初每升培养基仅获得约0.2毫克纯化蛋白。通过选择最佳大肠杆菌菌种并优化表达条件，我们能够获得约10 mg/L的培养基产量，是原始量的10倍以上。由于纯化的蛋白是不含金属的脱辅基蛋白，因此用 Zn、Cu 和 Ni 对其进行重构。当我们测量脱辅基蛋白的紫外共振拉曼光谱时，在1478 cm^<-1>处观察到了被认为源自色氨酸的强带，但在Ni重建蛋白中，它移动到了1398 cm^<-1> .现阶段，我们还没有获得可以让我们讨论细节的高质量谱图，所以未来我们将进一步增加纯化蛋白的量，测量谱图，并创建突变体，以阐明蛋白质的信息传递机制。 p53.我正打算去那儿。