時間分解振動分光法による蛋白質高次構造変化の機能に果す役割の解明

使用时间分辨振动光谱阐明蛋白质构象变化在功能中的作用

• 批准号: 13308039
• 负责人: 北川 禎三
• 金额: $ 16.81万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13308039/
• 关键词: 振動分光; 時間分解共鳴ラマン; 共鳴ラマン; 赤外吸収; 蛋白質ダイナミクス; 蛋白質高次構造

基質の脱着に伴う蛋白質高次構造の超高速ダイナミクスを調べるために、本研究では蛋白にミオグロビン(Mb)を、リガンドに一酸化炭素(CO)を用いた。一酸化炭素結合形ミオグロビン(MbCO)のCOは光で解離する。すなわち、MbCOのFe-CO結合は可視レーザー光照射により300フェムト秒以内に切れる。COは蛋白外に出ていき、蛋白はdeoxyMbの平衡構造に向かって変化していくが、その過程をピコ秒の時間分解共鳴ラマン分光法で調べた。主光源は1.5ps幅、82MHz繰り返し、平均出力0.7WのTi : sapphireレーザーで、それをNd : YLFレーザーの倍波(527nm)で増幅し、1kHz繰り返しのパルス列にしてから2系列に分け、各々の波長に変換した。光解離にはOPG法で変換した540nmのパルスを用い、ラマン散乱励起光としてはメタンの誘導ラマン散乱で得た442nmのパルスを用いた。両パルスの時間相関幅は2.3psで遅延時間のゼロは0.2psの精度で決まっている。この測定系は国際的にもトップレベルで、同レベルのデータをとれるグループは国際的にも無いと云える光解離1ps後のスペクトルではFc-His伸縮(ν_<Fe-His>)は222Cm^<-1>に、ヘムの面外振動(γ_7)が300cm^<-1>に、側鎖C_βC_cC_d変角振動[δ(C_βC_cC_d)]が369cm^<-1>に観測された。ν_<Fe-His>及びγ_7バンドの面積強度を遅滞時間に対してフロットすると、γ_7は速い立ち上がりの後、一定強度を示したが、ν_<Fe-His>はその後20ps迄じわじわと強度増加を示した。解析の結果、これはMbCO形ではヘム面内に位置していた鉄イオンが、deoxy形でヘム面より0.3ÅだけHis側にずれる構造変化を反映している事がわかった。その変化の80%は非常に速いが残り20%が1〜20psで起こる。一方ν_<Fe-His>振動数は、時定数106±14psで低波数シフトしたが、ポルフィリン環のγ_7やδ(C_βC_cC_d)バンドはその様なシフトを示さなかった。また蛋白のない鉄ポルフィリンイミダゾール錯体のCO光解離でも、ν_<Fe-lm>はν_<Fe-His>.バンドと同じように強度の時間変化を示したが、振動数変化は示さなかった。したがってν_<Fe-His>の振動数の時間変化は、蛋白質の3次構造の時間変化を反映しているものと思われる。

在本研究中，我们使用肌红蛋白（Mb）作为蛋白质，一氧化碳（CO）作为配体，研究底物解吸过程中蛋白质构象的超快动力学。一氧化碳结合肌红蛋白 (MbCO) 中的 CO 会被光解离。即，MbCO中的Fe-CO键在可见激光照射下在300飞秒内断裂。 CO 离开蛋白质，蛋白质向脱氧 Mb 的平衡结构转变，使用皮秒时间分辨共振拉曼光谱研究了这一过程。主光源为Ti：蓝宝石激光器，宽度为1.5 ps，重复频率为82 MHz，平均输出为0.7 W。用Nd：YLF激光器（527 nm）的谐波放大，制成重复率为 1 kHz 的脉冲串，然后将脉冲串分为两串，每串都转换为波长。将通过OPG法转换的540nm脉冲用于光解离，将通过甲烷受激拉曼散射获得的442nm脉冲用作拉曼散射激发光。两个脉冲的时间相关宽度均为2.3 ps，零延迟时间的确定精度为0.2 ps。该测量系统处于国际顶尖水平，可以说世界上没有其他团队能够获得同等水平的数据。在光解离1 ps后的光谱中，Fc-His伸缩（ν_<Fe -他的>)是在222Cm^-1>，在300cm^-1>观察到血红素面外振动(γ_7)，在369cm^-1>观察到侧链C_βC_cC_d弯曲振动[δ(C_βC_cC_d)]。当绘制 ν_<Fe-His> 和 γ_7 谱带的面积强度与延迟时间的关系时，γ_7 在快速上升后显示出恒定的强度，但 ν_<Fe-His> 的强度逐渐增加，直到 20 ps 后才显示出来。分析结果发现，这反映了结构变化，其中MbCO形式位于血红素平面的铁离子从血红素平面向脱氧形式的His侧移动了0.3 Å。 80%的变化非常快，但剩下的20%发生在1-20 ps内。另一方面，ν_<Fe-His>频率向较低波数移动，时间常数为106±14 ps，但卟啉环的γ_7和δ(C_βC_cC_d)带没有表现出这种移动。此外，在无蛋白质的铁卟啉咪唑复合物的 CO 光解中，ν_<Fe-lm> 显示出强度的时间变化，类似于 ν_<Fe-His> 谱带，但没有频率变化。因此，ν_<Fe-His>频率的时间变化似乎反映了蛋白质三级结构的时间变化。

项目成果

N.Haruta, T.Kitagawa: "Time-resolved UV Resonance Raman Investigation of Protein Folding : Characterization of Kinetic and Equilibrium Intermediates of Apomyoglobin"Biochemistry. 41(印刷中). (2002)

N.Haruta、T.Kitakawa：“蛋白质折叠的时间分辨紫外共振拉曼研究：脱肌红蛋白的动力学和平衡中间体的表征”生物化学 41（出版中）。

北川 禎三 他: "生物と金属:金属イオンの生体内で働く仕組み"クバプロ. 207 (2001)

Teizo Kitakawa 等人：“生物学和金属：金属离子如何在生物体中发挥作用”KubaPro 207 (2001)。

Y Mizutani, T Kitagawa: "Vibrational Energy Relaxation of Metalloporphyrins in a Condensed Phase Probed by Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy"Bulletin of Chemical Society of Japan. 75. 1-17 (2002)

Y Mizutani、T Kitakawa：“通过时间分辨共振拉曼光谱探测凝聚相中金属卟啉的振动能量弛豫”日本化学会会刊。

S.G.Kruglik, P.Mojzes, Y.Mizutani, T.Kitagawa, P-Y.Turpin: "Time-resolved Resonance Raman Study of the Exciplex Formed Between Excited CuPorphyrin and DNA"Journal of Physical Chemistry. 105. 5018-5031 (2001)

S.G.Kruglik、P.Mojzes、Y.Mizutani、T.Kitakawa、P-Y.Turpin：“激发铜卟啉和 DNA 之间形成的激基复合物的时间分辨共振拉曼研究”物理化学杂志。

N.Haruta, M.Aki, S.Ozaki, Y.Watanab, T.Kitagawa: "Protein Conformation Change of Myoglobin upon Ligand Binding Probed by Ultraviolet Resonance Raman Spectroscopy"Biochemistry. 40. 6956-6963 (2001)

N.Haruta、M.Aki、S.Ozaki、Y.Watanab、T.Kitakawa：“通过紫外共振拉曼光谱探测配体结合时肌红蛋白的蛋白质构象变化”生物化学。