時間分解紫外共鳴ラマン分光法によるガスセンサーヘム蛋白の情報検出・伝達の構造化学的研究

使用时间分辨紫外共振拉曼光谱对气敏血红素蛋白信息检测和传输的结构化学研究

基本信息

批准号：
04F04382
负责人：
北川禎三
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

O_2、CO、NO等の気体分子を検出してそれを機能部位に伝達し生理機能を発揮する事は、生物が環境に即応して生きていくうえで非常に重要な事であるが、蛋白質による情報検出及び伝達の分子機構はよく分からず、現在のトップテーマとなっている。本研究では、それを紫外共鳴ラマン法で蛋白質の分子振動を観測して解明する事を目的とする。材料としては、大腸菌にあってO_2センサーとして働くDos蛋白を取り上げた。そのセンサードメインの遺伝子を東北大多元研の清水透教授からいただき、それを大腸菌で発現させた。培養した大腸菌よりDos蛋白を単離・精製する方法を東北大学に出向いて習い受け、一人で全実験をできるようになった。精製したDos蛋白の酸化形、還元形、CO結合形の244及び229nmの励起の共鳴ラマンスペクトルを高いシグナル/ノイズ比で得る事に成功した。トリプトファンとチロシンのラマンバンドが観測された。センサードメインには53番と110番に2つのトリプトファンがあり、53番をフェニルアラニンに置換したW53F及び110番をイソロイシンに置換したW110Iミュータントを部位特異的アミノ酸置換法で遺伝子工学的につくり出した。酸化形と還元形のネイティブ分子の差スペクトルは、W110Iでは再現されたがW53Fでは再現されず、差ピークは無かった。この事はヘム鉄の酸化により53番トリプトファンが構造変化を示す事が明らかとなった。今回はDos蛋白のセンサードメインのみを調べたが、次のステップでは全長のDos蛋白質を発現させ、それに同種の実験でヘム鉄の酸化還元による蛋白部分の構造変化を紫外共鳴ラマン法で調べていく予定である。実験は順調に進み、2報の論文を書き終わっている。

检测O_2、CO、NO等气体分子并将其传送到功能位点执行生理功能对于生物体对环境做出快速反应极为重要，但蛋白质信息检测和传递的分子机制尚不十分清楚，且尚不清楚。目前是热门话题。本研究的目的是通过使用紫外共振拉曼方法观察蛋白质的分子振动来澄清这一点。使用的材料是 Dos 蛋白，它存在于大肠杆菌中，充当 O_2 传感器。我们从东北大学多学科研究所的清水彻教授那里获得了传感器结构域的基因，并在大肠杆菌中进行了表达。在前往东北大学学习如何从培养的大肠杆菌中分离纯化Dos蛋白后，他能够自己完成所有实验。我们成功获得了纯化 Dos 蛋白的氧化、还原和共键形式的 244 和 229 nm 激发共振拉曼光谱，具有高信噪比。观察到色氨酸和酪氨酸的拉曼带。传感器结构域在位置 53 和 110 处有两个色氨酸，并且使用位点特异性氨基酸对位置 53 替换为苯丙氨酸的 W53F 突变体和位置 110 替换为异亮氨酸的 W110I 突变体进行了基因工程改造。替代法。 W110I 重现了氧化和还原的天然分子之间的差异光谱，但 W53F 没有重现，并且没有差异峰。这表明色氨酸 53 由于血红素铁的氧化而显示出结构变化。这次，我们只研究了Dos蛋白的传感器结构域，但在下一步中，我们将表达全长Dos蛋白并进行类似的实验，以研究由于血红素铁的氧化还原而导致的蛋白质部分的结构变化计划采用紫外共振拉曼法。实验进展顺利，已经写了两篇论文。