ウエルシュ菌ε毒素のレセプターの同定と細胞膜ラフトにおける7量体形成機構の解析

产气荚膜梭菌ε毒素受体的鉴定及质膜筏七聚体形成机制分析

基本信息

批准号：
14770120
负责人：
宮田茂
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Kagawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ウエルシュ菌のε毒素は、超微量(3x10^<-11>M以下)でマウスを死に至らしめる。一方で、Madin-Darby canine kidney(MDCK)細胞に対して細胞毒性を示し、その細胞膜にイオン透過性の細孔であるSDS耐性の7量体を形成する。マウスに静脈内投与したε毒素が腎臓と脳・中枢神経系に局在することや感受性細胞が限定されることから、特異的なレセプターの存在が示唆された。また、ε毒素は、主にraftと呼ばれるスフィンゴ脂質とコレステロールに富む非イオン性界面活性剤不溶性膜領域(detergent-resistant membranes,DRMs)に結合し、DRMで7量体を形成することを明らかにした。さらに、DRM構成脂質の変化がMDCK細胞に対する細胞毒性に及ぼす影響を調べた。細胞膜中のコレステロールやスフィンゴミエリンを減少させた結果、毒素感受性が低下した。ε毒素の毒性発現には、DRMのintegrityが重要であると考えられた。一方、スフィンゴ糖脂質の減少は、感受性をむしろ亢進させた。反対に、細胞に外部からガングリオシドG_<M1>を取り込ませた場合、ε毒素の細胞毒性が顕著に低下した。ε毒素はガングリオシドG_<M1>に結合しなかったことより、レセプターに影響を与えていると考えられた。スフィンゴ糖脂質のどの部分が影響を与えているのか調べるために、スルファチド、アシアロG_<M1>、ガラクトシルセラミド、N-アセチルノイラミン酸、N-アセチルノイラミニルラクトース存在下で感受性を調べた結果、スルファチド存在下でわずかに感受性が低下した。一方、細胞をシアリダーゼ処理した場合、感受性が亢進した。これらのことから、DRM表面における陰性電荷の存在の変化が、ε毒素感受性を変化させていると考えられた。DRMに局在する特異的なレセプターを介して標的細胞に結合し、DRMのmembrane potentialにより超微量でも効率よく7量体を形成し、細胞膜に挿入することにより細孔をあけ、細胞死を引き起こしていると推察された。

产气荚膜梭菌的ε-毒素极少量(小于3x10^-11M)即可导致小鼠死亡。另一方面，它对 Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞具有细胞毒性，在细胞膜上形成 SDS 抗性七聚体，即离子渗透孔。通过静脉注射给小鼠的肾脏、大脑和中枢神经系统中的ε-毒素的定位以及有限数量的敏感细胞表明特定受体的存在。此外，还发现ε-毒素主要与富含被称为筏和胆固醇的鞘脂的非离子表面活性剂不溶性膜（DRM）结合，并与DRM形成七聚体。此外，我们研究了 DRM 成分脂质的变化对 MDCK 细胞细胞毒性的影响。由于细胞膜中的胆固醇和鞘磷脂减少，对毒素的敏感性降低。 DRM 完整性被认为对于 ε-毒素的毒性很重要。另一方面，鞘糖脂的减少实际上增加了敏感性。另一方面，当从外部将神经节苷脂G_<M1>引入细胞中时，ε-毒素的细胞毒性显着降低。由于ε-毒素不与神经节苷脂G_<M1>结合，因此认为它影响受体。为了研究鞘糖脂的哪一部分受到影响，研究了硫苷脂、去唾液酸G_<M1>、半乳糖神经酰胺、N-乙酰神经氨酸和N-乙酰神经氨酰乳糖存在下的敏感性。存在硫苷脂时敏感性略有降低。另一方面，当细胞用唾液酸酶处理时，敏感性增加。这些结果表明 DRM 表面负电荷的变化改变了 ε-毒素的敏感性。它通过位于 DRM 中的特定受体与靶细胞结合，并且由于 DRM 的膜电位，即使在超痕量的情况下，它也能有效地形成七聚体，该七聚体插入细胞膜中以打开孔并导致细胞死亡。