DNA架橋修復に重要なFANCD2－FANCI複合体の機能及び構造解析

FANCD2-FANCI 复合物的功能和结构分析对 DNA 交联修复很重要

• 批准号: 10J02700
• 负责人: 佐藤 浩一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J02700/
• 关键词: Fanconi anemia; FANCD2; histone chaperone; Fanconi anemia pathway; ファンコニ貧血; FA経路; DNA修復; Fanconi anemia; FANCD2; histone chaperone; Fanconi anemia pathway; ファンコニ貧血; FA経路; DNA修復

これまでの研究で、DNA架橋修復に重要なFANCD2-FANCI複合体がヒストンシャペロン活性を有しており、FANCD2が触媒サブユニットとして、FANCIが活性調節サブユニットとして働くことを見出してきた。更に、FANCD2はC末端領域でピストンH3/H4複合体と相互作用し、ニワトリFANCD2(cFANCD2)においてアミノ酸R1336とK1346がヒストンシャペロン活性に重要であることを明らかにした。また、このFANCD2変異体をDT40細胞にノックインしても、DT40細胞のDNA架橋剤への感受性が相補されなかったことから、FANCD2のヒストンシャペロン活性はDNA架橋修復に重要な役割を果たすことが示唆された。平成24年度は、DNA架橋修復の不全で発症するファンコニ貧血という遺伝病と、FANCD2のヒストンシャペロン活性の関連性を解析した。ファンコニ貧血患者では、ヒトFANCD2 R302Wの変異が見つかっている。cFANCD2 R305Wをリコンビナントタンパク質として精製し、スーパーコイリングアッセイによりヒストンシャペロン活性を測定したところ、野生型FANCD2に比べ著しくヒストンシャペロン活性が低下していた。更に、この変異体をDT40細胞にノックインしたところ、DNA損傷依存的にクロマチンに集積するものの、DNA架橋剤への感受性は完全には相補されなかった。また、FANCD2をノックダウンしたHeLa細胞において、ヒトFANCD2 R302Wの変異体を発現させても、ピストンH3の細胞内動態は相補されなかった。これら一連の解析で、DNA架橋修復においてFANCD2のヒストンシャペロン活性は、ID複合体がクロマチンに集積した後に重要な役割を果たすこと、そしてヒストンシャペロン活性を低下させる変異がファンコニ貧血の原因になりえることが明らかになった。

先前的研究发现，对于DNA交叉链接修复很重要的Fancd2-fanci复合物具有组蛋白伴侣活性，fancd2充当催化亚基，而富康则充当活性调节亚基。此外，FANCD2与C末端区域的活塞H3/H4复合物相互作用，表明氨基酸R1336和K1346对于鸡肉FANCD2中的组蛋白伴侣活性很重要（CFANCD2）。此外，将这种FANCD2突变体敲入DT40细胞并不补充DT40细胞对DNA交联剂的敏感性，这表明FANCD2的组蛋白伴侣伴侣活性在DNA交联修复中起重要作用。 2012年，我们分析了称为Fanconi贫血的遗传疾病之间的关系，该疾病是由于DNA交联的修复不足而引起的，而FANCD2的组蛋白伴侣活性。在Fanconi贫血患者中发现了人FANCD2 R302W的突变。 CFANCD2 R305W被纯化为重组蛋白，并使用超串联测定法测量组蛋白伴侣活性，与野生型FANCD2相比，组蛋白伴侣的活性显着降低。此外，当将该突变体撞到DT40细胞中时，尽管它以DNA损伤依赖性方式积聚在染色质中时，其对DNA交联剂的敏感性并未完全补充。此外，在fancd2上撞倒的HeLa细胞中人fancd2 R302W突变体的表达并不补充活塞H3的细胞内动力学。这些一系列的分析表明，在ID复合物在染色质中累积后，DNA交叉链接修复中FANCD2的组蛋白伴侣活性起着重要作用，并且降低组蛋白伴侣活性的突变会导致fanconi贫血。