染色体におけるDNAとRNAの相互作用を検出する技術の開発

开发检测染色体中DNA和RNA相互作用的技术

• 批准号: 10F00757
• 负责人: CARNINCI Piero
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10F00757/
• 关键词: クロマチン; ノンコーディングRNA; ライゲーション; 相互作用; 配列決定; マッピング; ncRNAs; chromatin; Adaptor; genomic DNA; sequencing; mapping; ligation; non coding RNAs

本研究の目的は、ヒトゲノムにおけるノンコーディングRNA(ncRNA)の機能の役割とメカニズムを研究することです。タンパク質をコードするゲノム配列は2%未満ですが、ncRNAは哺乳類ゲノムの主要な転写産物です。ncRNAは転写干渉によって抑制を仲介することも、クロマチン領域をシスまたはトランスに結合させるなどのさまざまなメカニズムを使って転写を活発化させることもできます。ncRNAはどのように核内因子を結合させるのか、その機能のメカニズムを正確に理解し、ガンなどの一部の疾病におけるncRNAの役割を解明する試みは重要と思われます。ncRNAのメカニズムを調査するためには、ncRNAとクロマチンの結合の特徴をよりよく理解し、その法則を明らかにするための新たな技術が必要です。私たちは染色体領域間の相互作用全般、およびクロマチンとそのクロマチンに結合したRNAとの相互作用を同定できる全クロマチンネットワーク(GCN)法を開発したいと考えています。この方法は次世代DNAシーケンサーを用い、核内で物理的に近接しているDNA-DNA、DNA-RNA領域を確認できるようにします。結果:2011年度、私たちはDNAおよびRNAの短い合成分子を用いたプロトコルを開発。2012年度にはついにこの方法論をマウスのES細胞から抽出したクロマチンのサンプル内で直接使用し、核のDNA-RNA相互作用を確認しました。また、別のライブラリーを作り、Hiseq2000でシーケンスを行うこともできました。「ノイズ」のレベルを削減し、より多くのデータを得るにはプロトコルの改良が必要ですが、この方法は非常に有望と思われます。また、この技術を可能な限り最適化するほかの試みも進行中です。DNA-RNA相互作用を確認したら、哺乳類の細胞内では初めてとなる、ncRNAとゲノムDNAとの相互作用の詳細なマッピングを行うため、FISH(蛍光インサイツハイブリダイゼーション法)を用いて、それらを検証したいと考えています。

这项研究的目的是研究人基因组中非编码RNA（NCRNA）的功能作用和机制。尽管蛋白质编码小于2％，但NCRNA是哺乳动物基因组的主要转录本。 NCRNA可以通过转录干扰介导抑制作用，或者它们可以使用多种机制（例如将染色质区域与顺式或Trans结合）激活转录。尝试准确了解NCRNA如何结合核因子，其功能的机制，并阐明NCRNA在某些癌症等疾病中的作用，这似乎很重要。为了研究NCRNA的机制，需要新技术来更好地了解NCRNA结合和染色质结合的特征并阐明其规则。我们想开发一种总染色质网络（GCN）方法，该方法可以识别染色体区域之间的一般相互作用以及染色质及其RNA与染色质蛋白蛋白结合的RNA之间的相互作用。该方法使用下一代的DNA测序仪使您能够检查核内物理上彼此近距离接近的DNA-DNA和DNA-RNA区域。结果：2011年，我们使用DNA和RNA的短合成分子开发了一种方案。在2012年，该方法最终直接用于从小鼠ES细胞中提取的染色质样品中，以证实核DNA-RNA相互作用。我还能够创建另一个库，并使用HISEQ2000对其进行排序。降低“噪声”水平并获得更多数据需要改进的协议，但是这种方法似乎很有希望。也正在进行其他尝试以尽可能优化该技术。一旦确认了DNA-RNA相互作用，我们想使用鱼（荧光原位杂交方法）对它们进行验证，以提供NCRNA与基因组DNA之间相互作用的详细映射，这是哺乳动物细胞中的第一次。

项目成果

New Methodology to study the three-dimensional Genome-RNA-protein superstructures that control biological output

研究控制生物输出的三维基因组-RNA-蛋白质超结构的新方法

• 发表时间: 2011
• 作者: De Antoni Andrea;Chris Feldman;John Traphagan (eds.);Elisa Sorrivi;SORRIVI Elisa;ギロッテイ マルコ
• 通讯作者: ギロッテイ マルコ