Creation of artificial genetic system with acyclic artificial nucleic acids and application to evolutionary molecular engineering

无环人工核酸人工遗传系统的构建及其在进化分子工程中的应用

基本信息

批准号：
21H05025
负责人：
浅沼浩之
金额：
$ 121.89万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-05 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H05025/
关键词：
人工核酸 Pre-RNA world 化学ライゲーション SNA L-aTNA

项目摘要

L-aTNAの複製と同様にL-aTNAのランダム配列プールを使用して、17-merの鋳型DNA鎖およびRNA鎖のL-aTNA鎖への逆転写を検討した。DNAを鋳型鎖に用いた場合は、L-aTNA 4 merのランダム配列プールを用い16 merのDNA鋳型鎖と8 merのL-aTNAプライマーで逆転写を実現した。一方RNAを鋳型に用いた場合は、L-aTNAの複製と同じ3-merのランダム配列プールでL-aTNAへの逆転写を実現した。DNAを鋳型鎖に用いてDNA鎖の非酵素的ライゲーションを検討した結果、Mn2+よりCd2+, Co2+, Ni2+など、イミダゾールと強く相互作用する金属イオンの方がライゲーション活性の向上が顕著であった。Cd2+で最適化したところ、酵素（リガーゼ）に匹敵する活性が得られた。さらに反応速度論解析から、CNImによるリン酸の活性化が律速段階であることが判明した。その解析を基にL-aTNA鎖のプライマー伸長反応を再検討し、伸長方向をこれまでの逆の1’→3‘にしてCd2+を使用することで、29merのL-aTNA鋳型鎖を4℃4時間で80%以上の収率で得られた。前年度配列既知の10 merのSNAに対して相補配列を持つDNAを、そのランダムプールから釣り上げられることを示した。そこで更に長い20 merのSNAを釣り上げる方法を検討した。その結果、中央に配列既知の2 merを挿入してランダマイズしたDNA 10merを使用すれば、20 merのSNAに対して10 merずつ分割して相補的なDNAが釣れることが判った。前年度開始する予定だったL-aTNA鎖のサーマルサイクルによる自己複製を検討した。まずは16 merのL-aTNA鋳型鎖に相補的な2つの8 merのL-aTNAフラグメントの連結反応がサーマルサイクルで自己増幅可能か検討した。鋳型鎖に対してプライマーとフラグメント鎖を過剰に加え、連結反応（2h, 25℃）→加熱（94℃）→急冷(0℃)というサイクルを回したところ、サイクル毎に連結産物の増加が観察され、4サイクル後は鋳型鎖に対して150%の収率で連結産物が得られた。

使用L-ATNA的随机序列以及L-ATNA的复制，研究了17-MER模板DNA和RNA链的逆转录到L-ATNA链中。当将DNA用作模板链时，使用16个MER DNA模板链和8个MER L-ATNA引物的L-ATNA 4 MER的随机序列池实现了逆转录。另一方面，当将RNA用作模板时，使用与L-ATNA复制相同的3-Mer随机序列池实现逆转录到L-ATNA。由于使用DNA作为模板链检查DNA链的非酶结扎，与咪唑强烈相互作用的金属离子（例如CD2+，CO2+和Ni2+）在连接活性上比MN2+显示出更为明显的联系。当用CD2+优化时，获得与酶（连接酶）相当的活性。此外，动力学分析表明，CNIM对磷酸盐的激活是限制步骤。基于此分析，重新审查L-ATNA链的引物延伸反应，并使用CD2+，将延伸方向相反，转换为先前的反转1'→3'，在4小时时，在4°C时以40％或更多的速度获得了29mer L-ATNA模板链。与上一年已知序列的10个MER SNA的互补序列的DNA显示出是从随机池中钓鱼的。因此，我们考虑了一种捕获更长的20 mer sna的方法。结果，发现使用10mer DNA通过在中心插入2个已知序列的10mer DNA，可以通过将10个MER分为20 mers来捕获互补的DNA。我们通过预定在上一年开始的热周期研究了L-ATNA链的自我复制。首先，我们研究了是否可以通过热周期来自增加与16个MER L-ATNA模板链互补的两个8 mer L-ATNA片段的连接反应。将过量的底漆和碎片链添加到模板链中，并进行连接反应的周期（2H，25°C）→加热（94°C）→淬火（0°C），并观察到与每个周期一起观察到的结扎产物增加，以及在四个周期中获得的连接产物以150％的收益率获得了150％的模糊剂。