化学修飾DNAを用いた遺伝子発現の光制御

使用化学修饰 DNA 光控制基因表达

基本信息

批准号：
13022210
负责人：
浅沼浩之
金额：
$ 2.62万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子の発現形態であるタンパク質は、DNAの塩基配列にシンクロナイズして生産される。DNAの化学修飾は、このような遺伝子発現などへの応用から多くの注目が集められ、これまで数多くの報告がされてきた。しかし光のような外部刺激に応答して遺伝子発現を可逆的に制御した例はほとんど報告されていない。我々は、光照射で可逆的に構造異性化するアゾベンゼンを組み込んだ化学修飾DNAを合成し、これを用いて遺伝子発現の光制御を目指す。前年度我々は、T7プロモーターにアゾベンゼンを導入することで、T7-RNAポリメラーゼ(T7-RNAP)による転写反応のOn-Off光制御の実現に成功した。本年度はT7の代わりにSP6-RNAPを使用し、プロモーターへのアゾベンゼン導入による転写反応の光制御に汎用性があるかどうかについて検討した。ファージRNAPの一種であるSP6-RNAPの17塩基対からなるプロモーター配列はRNAP結合領域とTATA領域を含む転写開始領域といった二つの領域に分けられる。そこで、この2つの領域にアゾベンゼンを導入し、転写反応の光制御効果を検討した。アゾベンゼン残基を含まない天然のプロモーターを用いた場合には迅速な転写反応が進行し、UV照射下と未照射下で転写速度に差はほとんど認められなかった。一方アゾベンゼン残基をTATA領域のNon-template strand側の-1位と+1位の間と、RNAP結合領域の-11位と-12位の間にそれぞれ導入したプロモーターを用いたところ、UV未照射下では転写反応が著しく抑制された。それに対してインキュベーション前に1分間UV照射したところ、転写が効率よく進行することが明らかとなった(図1 lane4-6)。以上より、アゾベンゼンをSP6 RNAPのプロモーターに導入することでも、転写反応のON/OFF的な光制御に成功した。また、RNase H反応の光制御にも成功した。

蛋白质是基因的表达形式，与DNA的碱基序列同步产生。 DNA化学修饰因其在基因表达中的应用而受到广泛关注，迄今为止已有许多报道。然而，很少有关于基因表达响应光等外部刺激的可逆控制的报道。我们的目标是合成掺有偶氮苯的化学修饰DNA，该DNA在光照射下可逆地发生结构异构化，并用它来光学控制基因表达。去年，我们通过在T7启动子中引入偶氮苯，成功实现了T7-RNA聚合酶（T7-RNAP）转录反应的开关光学控制。今年，我们使用 SP6-RNAP 代替 T7，并研究了通过在启动子中引入偶氮苯来光控制转录反应是否具有通用性。 SP6-RNAP（一种噬菌体RNAP）的17个碱基对启动子序列分为两个区域：RNAP结合区和包含TATA区的转录起始区。因此，我们将偶氮苯引入这两个区域并研究光控制对转录反应的影响。当使用不含偶氮苯残基的天然启动子时，转录反应迅速进行，并且UV照射和未照射之间的转录率几乎没有差异。另一方面，当我们使用在TATA区域的非模板链侧的位置-1和+1之间以及RNAP结合区域的位置-11和-12之间引入偶氮苯残基的启动子时，紫外线防护实现了在辐射下显着抑制转录反应。另一方面，当在孵育前施加紫外线照射1分钟时，表明转移有效地进行（图1泳道4-6）。综上所述，我们通过将偶氮苯引入到SP6 RNAP的启动子中，成功地以ON/OFF方式控制转录反应。他们还成功地光控了 RNase H 反应。