化学修飾DNAを用いた遺伝子発現の光制御

使用化学修饰 DNA 光控制基因表达

基本信息

批准号：
11167216
负责人：
浅沼浩之
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11167216/
关键词：
アゾベンゼン核酸 DNA 融解温度二重鎖三重鎖光制御スピロピラン

项目摘要

本申請では、遺伝子発現の光制御を目指している。前年度我々は、トリメチレンリンカーの中心の炭素にアゾベンゼンを導入した修飾DNAを合成し、アゾベンゼンの光異性化によって二重鎖の形成と解離を光のみで制御できることを明らかにしている。本年度はその機構を明らかにするため、アゾベンゼンを含むDNAの二重鎖の構造を2D NMRによって解析した。その結果、1)trans-アゾベンゼンが隣接する塩基対間にインターカレートしている、2)trans-アゾベンゼンがインターカレートすることでメジャーグルーブ側に傾いている、ことが判明した。一方cis-体は非平面分子であるため、スタッキングによる安定化が得られずむしろ立体障害で不安定化し、結果としてtrans→cis異性化によって二重鎖形成能が大きく変化することが明らかとなった。また、NOESYの詳細な解析から、極性の高い成分はRのコンフィギュレーションであることも明らかにした。更に光応答性DNAを、T7-DNAポリメラーゼによるDNAの伸長反応に応用し、目論見どおりアゾベンゼンの光異性化で、伸長反応をON-OFF制御できることを明らかにした。更に詳細な解析から、モジュレーターが5'末端付近から徐々に剥がれるような機構で光制御が実現できていることを見出した。光応答性DNAを酵素反応の制御に応用するためには、天然の構造からの差異は小さいほうが良い。そこでリボースの2'Oにアゾベンゼンを導入したウリジンを合成し、DNA内に組み込んだ。この系は配列依存性が大きいが、trans-cis異性化でTmが変化することを見出した。また、アゾベンゼンと並んで代表的な光異性化分子であるスピロピラン導入DNAも合成に成功した。

该应用旨在轻轻控制基因表达。上一年，我们将修饰的DNA与偶氮苯一起引入了三甲基接头中心的碳中，揭示了偶氮苯的光异构化可以单独控制双链的形成和解离。为了阐明这种机制，通过2D NMR分析了含氮苯苯DNA的双链的结构。结果表明，1）反苯苯在相邻的碱基对之间的插入，以及2）反矩阵插入和倾斜朝向主要的凹槽侧。另一方面，由于顺式形式是非平面分子，因此不能通过堆叠稳定，而是通过空间障碍而破坏了稳定，从而导致形成双重链的能力发生了显着变化，这是由于反式→CIS异构化而形成双链的能力。此外，对Noesy的详细分析表明，高度极性成分是R. R.此外，将光反应性DNA应用于与T7-DNA聚合酶的DNA扩展反应，并且按计划，可以揭示扩展反应可以通过偶合反应的光相位来控制，从而可以控制偶氮生物的光相位。更详细的分析表明，通过一种机制，调节器逐渐从5'末端脱落的机制可以进行光控制。为了施加光反应DNA来控制酶促反应，最好与自然结构有很小的差异。因此，将尿苷与偶氮苯合成，并引入2'O核糖并掺入DNA中。尽管该系统具有较大的序列依赖性，但发现在反式CIS异构化时TM发生变化。此外，螺旋形引入DNA（典型的光异构分子）也成功合成。