生細胞内のRNAポリメラーゼII動態の計測

测量活细胞中的 RNA 聚合酶 II 动态

基本信息

批准号：
10F00712
负责人：
木村宏
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物のRNAポリメラーゼIIは、遺伝子の転写を担う重要な酵素であり、十数個のサブユニットから構成される。生きた細胞の中で、RNAポリメラーゼがどのように転写開始、伸長、終結を行うのかを明らかにすることは、遺伝子発現制御を理解するうえで非常に重要である。これまでにもGFP融合蛋白質を用いてRNAポリメラーゼIIの生細胞における分子動態が解析されてきたが、個々の報告で異なるモデルと結果が得られておりその全容の解明には至っていない。本研究は、RNAポリメラーゼIIの状態に応じて付加される翻訳後修飾の違いを利用して、そのプロモータ上へのリクルート、転写開始、転写伸長の各ステップに至るキネティクスを明らかにするとともに、ヒストン修飾などクロマチン構造の変化と転写制御の関係を生きた細胞で明らかにすることを目的として行った。昨年度の研究で、Fabを用いた内在性RNAポリメラーゼII検出系を構築し、転写誘導に伴うRNAポリメラーゼIIの動態を計測した。本年度は、その計測結果の定量化を行った。また、ヒストンH3K27のアセチル化の変動も合わせて解析を行った。さらに、定量的ウェスタンブロッティングにより、細胞あたりのRNAポリメラーゼIIの総量と特定のリン酸化状態にある分子数を見積もった。そして、RNAポリメラーゼIIの集積、転写開始、転写伸長のキネティックモデルの構築とシミュレーションを行い、RNAポリメラーゼIIの数と生細胞計測により得られた集積曲線に最もよく適合する数値を導き出した。その結果、遺伝子のプロモータにリクルートされたRNAポリメラーゼIIが、転写開始に至るまでに、複数回の解離と結合を繰り返すこと、また、転写開始から伸長に至る過程は比較的効率が高いこと、また、ヒストンの脱アセチル化が新規転写を抑制する可能性があることなどが示唆された。

真核RNA聚合酶II是负责基因转录的重要酶，由十多个亚基组成。阐明 RNA 聚合酶如何在活细胞中启动、延伸和终止转录对于理解基因表达调控极其重要。人们已经使用 GFP 融合蛋白对活细胞中 RNA 聚合酶 II 的分子动力学进行了分析，但个别报告得出了不同的模型和结果，并且完整的情况尚未阐明。本研究利用根据 RNA 聚合酶 II 的状态添加的翻译后修饰的差异来阐明其募集至启动子、转录起始和转录延伸步骤的动力学，并阐明其之间的关系。染色质结构的变化，例如活细胞中的修饰和转录调节。在去年的研究中，我们利用Fab构建了内源性RNA聚合酶II检测系统，并测量了伴随转录诱导的RNA聚合酶II的动态。今年，我们对测量结果进行了量化。我们还分析了组蛋白 H3K27 乙酰化的变化。此外，我们通过定量蛋白质印迹估计了每个细胞的 RNA 聚合酶 II 总量和处于特定磷酸化状态的分子数量。然后，他们构建并模拟了 RNA 聚合酶 II 积累、转录起始和转录延伸的动力学模型，并导出了最适合 RNA 聚合酶 II 数量和从活细胞测量中获得的积累曲线的值。结果，招募到基因启动子的RNA聚合酶II在转录起始之前重复解离和结合多次，并且从转录起始到延伸的过程相对有效，这表明组蛋白去乙酰化可能抑制新的转录。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

蛋白質翻訳後修飾の生細胞イメージング

蛋白质翻译后修饰的活细胞成像

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich;木村宏
通讯作者：
木村宏

Timing the recruitment, initiation, and elongation of endogenous RNA polymerase II in single living cells

确定单个活细胞中内源性 RNA 聚合酶 II 的募集、起始和延伸时间

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich;木村宏;Timothy J Stasevich
通讯作者：
Timothy J Stasevich

Direct quantification of pol II recruitment, initiation, and elongation times in live cells

直接定量活细胞中 pol II 募集、起始和延伸时间

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich;木村宏;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich
通讯作者：
Timothy J Stasevich

Visualizing live-cell epigenetic modifications of endogenous RNA polymerase II and histones at an activated gene array

在激活的基因阵列上可视化内源性 RNA 聚合酶 II 和组蛋白的活细胞表观遗传修饰

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich
通讯作者：
Timothy J Stasevich

Visualizing the Transcription Cycle of RNA Polymerase II in Single Living Cells

可视化单个活细胞中 RNA 聚合酶 II 的转录周期

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich
通讯作者：
Timothy J Stasevich

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木村宏其他文献

小児期生体肝移植例に対する移植後ワクチン接種の検討

儿童活体肝移植患者移植后疫苗接种的考虑

DOI：
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
0
作者：
川田潤一;鈴木高子;安藤将太郎;神谷泰子;鈴木道雄;鳥居ゆか;木村宏;伊藤嘉規;鳥居ゆか　川田潤一　村田貴之　吉山裕規　鈴木道雄　木村宏　伊藤嘉規;川田潤一　鈴木道雄　河野好彦　鳥居ゆか　　鈴木高子　安藤将太郎　神谷泰子　木村宏　伊藤嘉規;鈴木道雄　鈴木高子　安藤将太郎　神谷泰子　　鳥居ゆか　川田潤一　木村宏　伊藤嘉規
通讯作者：
鈴木道雄　鈴木高子　安藤将太郎　神谷泰子　　鳥居ゆか　川田潤一　木村宏　伊藤嘉規