マウスMCM関連タンパク質の解析

小鼠 MCM 相关蛋白分析

• 批准号: 06247201
• 负责人: 木村 宏
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06247201/
• 关键词: DNA複製; MCM遺伝子; MCM3; P1タンパク質; CDC46; Cdc21; 細胞周期; ライセンシングファクター

本年度の研究ではP1蛋白質を含むマウスMCM蛋白質の機能とその制御機構を明らかにするための基礎を築くことであった。本研究の成果は以下のとおりであり今後の機能解析へ向けてかなりの基礎的データを得ることができた。1.P1蛋白質と結合する90kDの蛋白質がマウスCDC46蛋白質であることを明らかにした。2.P1蛋白質が細胞周期に依存せず核に移行することを明らかにし、また、その核移行シグナルを同定した。CDC46蛋白質は核移行シグナルを持たないが、P1と結合することにより核に移行することが明らかになった。3.P1とCDC46は細胞周期を通じて常に結合すること、その結合には両蛋白質の全体的な構造が必要であることを明らかにした。また、CDC46はリン酸化を受けないことから、その核骨格との結合の制御にはP1のリン酸化が働いていることが推測された。4.大腸菌で発現させて精製したP1蛋白質を用いてマウス細胞抽出液によりin vitroでリン酸化反応を行い、in vivoのホスホペプチドマップと比較したところ、両者は比較的よく一致していた。このことから、P1蛋白質をリン酸化する酵素の同定が可能となった。5.大腸菌で様々な欠失変異体を作製し、in vitroでリン酸化反応を行いホスホペプチドマップを作製することによりP1蛋白質の少なくとも11あるリン酸化部位のうち4箇所の位置を推定できた。6.少なくとも大腸菌で発現させたP1蛋白質単独ではATPase活性は確認できなかった。7.マウスCdc21蛋白質の断片を大腸菌で発現させ、抗原とし、抗Cdc21抗体を作製した。その抗体を用いた免疫蛍光の結果から、Cdc21もP1やCDC46と同様に核に局在することが明らかになった。また、免疫沈降では、100kDのCdc21の他、80kDのMRP5(新規のマウスMCM蛋白質)、110kDおよび130kDの蛋白質が共沈した。これらのことから、MCM蛋白質は互いに結合し、巨大な蛋白質複合体を形成していることが明らかになった。

今年的研究旨在为阐明小鼠MCM蛋白（包括P1蛋白）的功能和调控机制奠定基础。本研究的结果如下，为今后的泛函分析获得了大量的基础数据。 1.我们发现与P1蛋白结合的90kD蛋白是小鼠CDC46蛋白。 2.我们揭示了P1蛋白与细胞周期无关地转位至细胞核，并鉴定了其核转位信号。尽管CDC46蛋白不具有核转位信号，但研究表明它通过与P1结合而转位至细胞核。 3.我们发现P1和CDC46在整个细胞周期中不断结合，并且这种结合需要两种蛋白质的整体结构。此外，由于CDC46不发生磷酸化，因此推测P1磷酸化在调节其与核骨架的结合中发挥作用。 4、利用大肠杆菌表达纯化的P1蛋白，用小鼠细胞提取物进行体外磷酸化，与体内磷酸化肽图谱对比，两者吻合较好。这使得鉴定磷酸化 P1 蛋白的酶成为可能。 5.通过在大肠杆菌中创建各种缺失突变体并在体外进行磷酸化反应以创建磷酸化肽图谱，我们能够估计P1蛋白中至少11个磷酸化位点中的4个的位置。 6. 至少，不能用大肠杆菌中单独表达的P1蛋白来证实ATPase活性。 7.小鼠Cdc21蛋白片段在大肠杆菌中表达，并用作抗原产生抗Cdc21抗体。使用该抗体的免疫荧光结果显示，Cdc21 与 P1 和 CDC46 一样，位于细胞核中。此外，在免疫沉淀中，除了100kD Cdc21之外，还共沉淀了80kD MRP5（一种新型小鼠MCM蛋白）以及110kD和130kD蛋白。这些发现表明 MCM 蛋白相互结合形成一个大的蛋白复合物。