遺伝子治療のための染色体複製起点由来のエピゾームベクターの開発に関する研究

用于基因治疗的染色体复制起点附加型载体的开发研究

• 批准号: 15659072
• 负责人: 正井 久雄
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659072/
• 关键词: エピゾームベクター; 遺伝子治療; ORC; 複製起点; 複製開始複合体; MCM; EBウィルス; oriP

遺伝子治療において、遺伝子導入に用いるベクターとしては、主に、ウィルスに由来したベクターが用いられているが、一長一短があり、種々の改良がなされている。一方、ウィルスに由来しない毒性の低い、自律複製能を有するエピソームベクターは、動物細胞ではまだ開発されていない。我々は、真核細胞の複製開始機構に基づいて、複製開始複合体を特定の配列にtargetすることにより、より効率良く複製複合体の構築をおこない、強い自律複製能を有するエピゾームベクターの開発を計画した。この目的のために、本年度は、分裂酵母ORCのDNA結合ドメインであるORC4のDNA結合ドメインをヒトORC4のN端に融合した分裂酵母-ヒトキメラORC4(Sp-huORC4)を作製し、動物細胞内で発現した。さらにこのplasmid上に、分裂酵母ORC4の標的配列であるAT-rich複製起点配列を導入した。このplasmidを現在動物細胞に導入し、一過性に自律的に複製できるかどうかを検討した。現在、さらに効率よく複製し、安定に維持されるベクターの開発をすすめている。

在基因治疗中，主要使用病毒来源的载体作为基因导入的载体，但它们各有优点和缺点，并且已经进行了各种改进。另一方面，非病毒来源、低毒性且具有自主复制能力的附加型载体尚未在动物细胞中开发出来。基于真核细胞的复制起始机制，我们的目标是通过将复制起始复合物靶向特定序列来更有效地构建复制复合物，并计划开发具有强自主复制能力的附加型载体。为此，今年我们创建了裂殖酵母-人嵌合体ORC4（Sp-huORC4），其中裂殖酵母ORC4的DNA结合结构域，也就是裂殖酵母ORC的DNA结合结构域，与N-表达了人类 ORC4 的末端。此外，富含AT的复制起点序列（裂殖酵母ORC4的靶序列）被引入到该质粒上。我们现在已经将该质粒引入到动物细胞中，并研究它是否可以瞬时自主复制。目前，我们正在开发复制效率更高且维护稳定的载体。

项目成果

Sato, N., Sato, M., Nakayama, M., Saitoh, R., Arai, K., Masai, H.: "Cell cycle regulation of chromatin binding and nuclear localization of Cdc7-ASK kinase complex"Genes to Cells. 8. 451-463 (2003)

Sato, N.、Sato, M.、Nakayama, M.、Saitoh, R.、Arai, K.、Masai, H.：“染色质结合的细胞周期调节和 Cdc7-ASK 激酶复合物的核定位”基因到细胞

正井久雄: "DNAとそれを認識する蛋白質の多様性と普遍性 蛋白質 核酸 酵素 特集 DNA二重らせん構造の半世紀(1)"共立出版. 589-591 (2003)

Hisao Masai：“DNA 和识别它的蛋白质的多样性和普遍性：蛋白质、核酸、酶专题：DNA 双螺旋结构的半个世纪 (1)”Kyoritsu Shuppan 589-591 (2003)。

A second human Dbf4/ASK-related protein, Drf1/ASKL1 is required for efficient completion of S and M phases.

第二种人类 Dbf4/ASK 相关蛋白 Drf1/ASKL1 是有效完成 S 期和 M 期所必需的。

• 发表时间: 2005
• 期刊: J.Biol.Chem. 280
• 作者: Yoshizawa;N.;Ishii;A.;Taniyama;C.;Matsui;E.;Arai;K.;Masai;H.
• 通讯作者: H.

You, Z., Ishimi, Y., Mizuno, T., Sugasawa, K., Hanaoka, F., Masai, H.: "Thymine-rich single-stranded DNA sequences specifically activate mouse Mcm4/6/7 helicase on Y-fork and bubble-like substrates."EMBO Journal. 22. 6148-6160 (2003)

You, Z.、Ishimi, Y.、Mizuno, T.、Sugasawa, K.、Hanaoka, F.、Masai, H.：“富含胸腺嘧啶的单链 DNA 序列特异性激活 Y 上的小鼠 Mcm4/6/7 解旋酶

Kim, J.M., Takemoto, N., Arai K., Masai, H.: "Hypomorphic mutation in an essential cell-cycle kinase causes growth retardation and impaired spermatogenesis"EMBO Journal. 22. 5260-5272 (2003)

Kim, J.M.、Takemoto, N.、Arai K.、Masai, H.：“重要细胞周期激酶的亚形突变导致生长迟缓和精子发生受损”EMBO 杂志。