極低温電子顕微鏡による細菌べん毛モーターと蛋白質輸送装置の像構造解析

使用低温电子显微镜对细菌鞭毛运动和蛋白质运输装置进行结构分析

基本信息

批准号：
21227006
负责人：
難波啓一
金额：
$ 131.12万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009-05-11 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21227006/
关键词：
細菌蛋白質ナノバイオナノマシン分子モーター

项目摘要

細菌べん毛は回転モーターとらせん繊維型プロペラなどで構成される超分子ナノマシンである。本研究は、回転モーターでタンパク質輸送装置でもあるべん毛基部体で、未だに多くが不明な構成タンパク質の立体構造と配置と相互作用を解明し、基部体の動作機構を明らかにするのが目的である。加速電圧300 kVの電子線には直径１ミクロンのサルモネラ菌は厚すぎて透過しづらいため、クライオ電子線トモグラフィーの解像度は10 nm以下に留まり、基部体の詳細な構造を見ることができない。そこで、FtsZの大量発現により直径0.4ミクロン程のミニ細胞を効率よく作成する条件を確立し、分解能を4 nm程度にまで向上させた。それぞれのミニ細胞には１～２本のべん毛と共に病原性因子分泌装置が複数見られた。両者はその構成蛋白質のアミノ酸配列相同性の高さと立体構造の類似性により、ともにIII型蛋白質輸送装置と呼ばれている。数多くのミニ細胞のトモグラムからべん毛基部体と病原性因子分泌装置の立体像を数十個抽出してそれぞれの平均像を求めた結果、これまで誰も見たことのなかったIII型蛋白質輸送に関わる複合体装置の細胞質側の立体構造が詳細に見え、両者の共通性と違いが明らかになった。また、大量発現系から精製したべん毛構成蛋白質のＸ線結晶解析により、べん毛蛋白質輸送に関わるFliH/I複合体とFliPのペリプラズムドメイン、そしてべん毛基部体ロッド蛋白質FlgGの結晶構造解析が完了した。

细菌鞭毛是由旋转电机和螺旋纤维螺旋桨组成的超分子纳米机器。本研究的目的是阐明鞭毛基体作为旋转马达和蛋白质运输装置的组成蛋白质的三维结构、排列和相互作用，并阐明鞭毛基体的运行机制，其中许多仍然未知。沙门氏菌直径为1微米，其厚度太厚，加速电压为300 kV的电子束无法穿透，因此冷冻电子断层扫描的分辨率始终低于10纳米，无法看到其详细结构。基体。因此，我们建立了通过表达大量FtsZ来有效创建直径约0.4微米的微细胞的条件，并将分辨率提高至约4nm。每个小细胞含有一个或两个鞭毛和多种毒力因子分泌装置。由于其组成蛋白具有高度的氨基酸序列同源性和3D结构相似性，两者都被称为III型蛋白转运蛋白。从大量微型细胞的断层图像中提取了数十张鞭毛基体和毒力因子分泌装置的 3D 图像，并找到了每个图像的平均图像，结果发现了一种以前从未见过的 III 型蛋白质。详细观察了参与运输的复杂装置的细胞质侧的三维结构，并揭示了两者之间的异同。此外，从大规模表达系统纯化的鞭毛组成蛋白的X射线晶体学揭示了参与鞭毛蛋白转运的FliH/I复合物、FliP的周质结构域以及鞭毛基体杆蛋白FlgG的晶体结构。分析完成。