クライオ電子顕微鏡による生体分子モーターの立体構造と機能の解明

使用冷冻电子显微镜阐明生物分子马达的三维结构和功能

• 批准号: 25000013
• 负责人: 難波 啓一
• 金额: $ 368.33万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013 至 2018
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25000013/
• 关键词: ナノマシン; べん毛モーター; クライオ電子顕微鏡; 単粒子像解析; Cリング構造; 回転スイッチ機構; MSリング構造; 輸送ゲート構造; 分子モーター; 立体構造; 光学顕微ナノ計測; ブラウン・ラチェット; 生物物理; ナノバイオ

べん毛モーターの回転機構の解明をめざして進めてきたべん毛基部体のクライオ電子顕微鏡による構造解析では、昨年から一層の進捗があった。信号タンパク質CheY-Pの非存在下では反時計回りにのみ回転する野生型モーターと、時計回りにのみ回転する変異型モーターの、2つの構造モデルを構築して精密化し、回転スイッチに関わる構造変化を明らかにしたとともに、モーター回転子のコア部分で膜貫通型タンパク質FliF複合体のMSリング、その中心部に結合する3種類の膜タンパク質FliP, FliQ, FliRからなる3型べん毛タンパク質輸送ゲートのらせん状複合体、そしてさらにその上に5種類のタンパク質FliE, FlgB, FlgC, FlgF, FlgGが順番にらせん状に重合してドライブシャフトとして働くロッドの構造についても、この巨大な複合体の全体構造を5Å分解能で解析し、各構成タンパク質の結晶構造やクライオ電顕による高分解能MSリング構造を組合わせて、分子モデルを構築することに成功した。両成果ともに投稿論文作成中である。心筋のトロポミオシン・トロポニン・アクチン繊維からなる細いフィラメントのクライオ電顕による構造解析では、トロポミオシンの全長の分子モデルを初めて構築してトロポミオシン間のジャンクション構造を明らかにするとともに、トロポニンを構成するの3種類のサブユニットがアクチン繊維の極めて広い領域にわたって結合する様子を解明した。また、Caイオン存在下と非存在下における2状態の構造を明らかにし、筋収縮の制御のしくみを支える構造変化を明らかにした。当該研究課題と並行して2010年から日本電子(株)と共同開発し、2016年夏にプロトタイプが完成した高度に自動化した新型クライオ電子顕微鏡CRYO ARM 200(加速電圧200kV)では、2017年夏に3日間の自動撮影で収集した約2500枚のβガラクトシダーゼの電顕像(35万粒子像)から2.4Å分解能を達成したが、その商用製品1号機として2018年6月に理研SPring-8センターに導入設置されたCRYO ARM 300(300kV)ではアポフェリチン球殻状構造のクライオ電顕像を撮影し、1日で自動撮影したわずか840枚の電顕像(12万粒子像)から、世界最高となる1.53Å分解能を達成した。この商用機はプロトタイプにはない冷陰極電界放射型電子銃(Cold FEG)が装備されているため電子線の干渉性がより高く、しかも300kVという高い加速電圧も寄与して電子光学系の解像度は1.0Å分解能に近いことがわかっている。今回得たアポフェリチンの3次元像マップでは、トリプトファン側鎖の五員環に孔が空き、メチオニン側鎖の炭素原子と硫黄原子のサイズに明確な違いが見えるなど、その解像度は原子分解能に近いもので、生体分子水溶液試料の構造解析における原子分解能の達成にむけて、Cold FEGを装備したクライオ電子顕微鏡の極めて大きなポテンシャルを示した。

自去年以来，使用冷冻电子显微镜对鞭毛基体进行了结构分析，目的是阐明鞭毛电动机的旋转机理。构建和完善了两个结构模型，这是一种野生型电动机，仅在没有信号蛋白Chey-P的情况下逆时针旋转，而突变体电动机仅旋转顺时针旋转，从而揭示了与旋转开关相关的结构变化。 We also analyzed the overall structure of this huge complex at 5 Å resolution, combining the MS ring of the transmembrane protein FliF complex at the core of the motor rotor, the helical complex of the type 3 flagella protein transport gate consisting of three types of membrane protein FliP, FliQ, and FliR that bind to the center of it, and the rod structure of five proteins FliE, FlgB, FlgC, FlgF, and FlgG that are依次聚合成螺旋形状，充当驱动轴。这两个结果目前都在提交文件的建设中。在心肌中由肌球蛋白，肌动蛋白和肌动蛋白纤维组成的细丝的冷冻电子显微镜的结构分析，创建了全肌球蛋白全长的第一个分子模型，以揭示肌动蛋白之间的连接结构，并阐明了三个亚纤维与troponin结合的三个亚纤维之间的结构，使得与troponin相结合。此外，在存在和不存在CA离子的情况下两个状态的结构被阐明，并阐明了支持肌肉收缩控制机制的结构变化。与该研究主题同时，新型高度自动化的冷冻电子显微镜冷冻臂200（加速度电压200KV）于2010年开发，并于2016年夏季完成了原型，从大约2,500β-Galactosidase电子显微镜（350,000颗粒体）摄入了2.4Å的分辨率。但是，2018年6月在Riken Spring-8中心安装的冷冻臂300（300KV）拍摄了带有丙哌丁蛋白球形壳的结构的低温电子显微镜，从一日捕获的仅840个电子显微镜（120,000个颗粒）的世界最高分辨率就可以实现全球最高的分辨率。该商用机器配备了原型中未发现的冷阴极场发射电子枪（冷FEG），因此电子束干扰较高，并且300 kV的高加速度电压贡献了贡献，使其知道电子光学系统的分辨率接近1.0Å分辨率。 In the three-dimensional image map of apoferritin obtained this time, holes are piled in the five-membered ring of the tryptophan side chain, and clear differences in the size of the carbon and sulfur atoms in the methionine side chain are visible, and the resolution is close to atomic resolution, showing extremely large potential of a cryo-electron microscope equipped with Cold FEG in order to achieve atomic resolution in structural analysis of水性生物分子样品。

项目成果

The unexpected role of polyubiquitin chains in the formation of fibrillar aggregates.

• DOI: 10.1038/ncomms7116
• 发表时间: 2015-01-20
• 期刊: NATURE COMMUNICATIONS
• 影响因子: 16.6
• 作者: Morimoto, Daichi;Walinda, Erik;Fukada, Harumi;Sou, Yu-Shin;Kageyama, Shun;Hoshino, Masaru;Fujii, Takashi;Tsuchiya, Hikaru;Saeki, Yasushi;Arita, Kyohei;Ariyoshi, Mariko;Tochio, Hidehito;Iwai, Kazuhiro;Namba, Keiichi;Komatsu, Masaaki;Tanaka, Keiji;Shirakawa, Masahiro
• 通讯作者: Shirakawa, Masahiro

A repeat unit of Vibrio diarrheal T3S effector subverts cytoskeletal actin homeostasis via binding to interstrand region of actin filaments.

• DOI: 10.1038/srep10870
• 发表时间: 2015-06-03
• 期刊: Scientific reports
• 影响因子: 4.6
• 作者: Nishimura M;Fujii T;Hiyoshi H;Makino F;Inoue H;Motooka D;Kodama T;Ohkubo T;Kobayashi Y;Nakamura S;Namba K;Iida T
• 通讯作者: Iida T

Novel Insights into Conformational Rearrangements of the Bacterial Flagellar Switch Complex

• DOI: 10.1128/mbio.00079-19
• 发表时间: 2019-04
• 期刊: mBio
• 影响因子: 6.4
• 作者: Tomofumi Sakai;T. Miyata;Naoya Terahara;K. Mori;Y. Inoue;Yusuke V. Morimoto;Takayuki Kato;K. Namba;T. Minamino

Determination of local pH differences within living Salmonella cells by high-resolution pH imaging based on pH-sensitive GFP derivative, pHluorin(M153R)

基于 pH 敏感 GFP 衍生物 pHluorin(M153R) 的高分辨率 pH 成像测定活沙​​门氏菌细胞内的局部 pH 差异

• DOI: 10.21769/bioprotoc.2529
• 发表时间: 2017
• 期刊: Bio-protocol
• 影响因子: 0.8
• 作者: Yusuke V. Morimoto;Nobunori Kami-ike;Keiichi Namba;Tohru Minamino
• 通讯作者: Tohru Minamino

Gwatch : the pipeline program for quick evaluation of sample quality in CryoEM.

Gwatch：用于快速评估 CryoEM 中样品质量的管道程序。