クライオ電子顕微鏡による生体分子モーターの立体構造と機能の解明

使用冷冻电子显微镜阐明生物分子马达的三维结构和功能

基本信息

批准号：
25000013
负责人：
難波啓一
金额：
$ 368.33万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013 至 2018
项目状态：
已结题

项目摘要

べん毛モーターの回転機構の解明をめざして進めてきたべん毛基部体のクライオ電子顕微鏡による構造解析では、昨年から一層の進捗があった。信号タンパク質CheY-Pの非存在下では反時計回りにのみ回転する野生型モーターと、時計回りにのみ回転する変異型モーターの、2つの構造モデルを構築して精密化し、回転スイッチに関わる構造変化を明らかにしたとともに、モーター回転子のコア部分で膜貫通型タンパク質FliF複合体のMSリング、その中心部に結合する3種類の膜タンパク質FliP, FliQ, FliRからなる3型べん毛タンパク質輸送ゲートのらせん状複合体、そしてさらにその上に5種類のタンパク質FliE, FlgB, FlgC, FlgF, FlgGが順番にらせん状に重合してドライブシャフトとして働くロッドの構造についても、この巨大な複合体の全体構造を5Å分解能で解析し、各構成タンパク質の結晶構造やクライオ電顕による高分解能MSリング構造を組合わせて、分子モデルを構築することに成功した。両成果ともに投稿論文作成中である。心筋のトロポミオシン・トロポニン・アクチン繊維からなる細いフィラメントのクライオ電顕による構造解析では、トロポミオシンの全長の分子モデルを初めて構築してトロポミオシン間のジャンクション構造を明らかにするとともに、トロポニンを構成するの3種類のサブユニットがアクチン繊維の極めて広い領域にわたって結合する様子を解明した。また、Caイオン存在下と非存在下における2状態の構造を明らかにし、筋収縮の制御のしくみを支える構造変化を明らかにした。当該研究課題と並行して2010年から日本電子(株)と共同開発し、2016年夏にプロトタイプが完成した高度に自動化した新型クライオ電子顕微鏡CRYO ARM 200(加速電圧200kV)では、2017年夏に3日間の自動撮影で収集した約2500枚のβガラクトシダーゼの電顕像(35万粒子像)から2.4Å分解能を達成したが、その商用製品1号機として2018年6月に理研SPring-8センターに導入設置されたCRYO ARM 300(300kV)ではアポフェリチン球殻状構造のクライオ電顕像を撮影し、1日で自動撮影したわずか840枚の電顕像(12万粒子像)から、世界最高となる1.53Å分解能を達成した。この商用機はプロトタイプにはない冷陰極電界放射型電子銃(Cold FEG)が装備されているため電子線の干渉性がより高く、しかも300kVという高い加速電圧も寄与して電子光学系の解像度は1.0Å分解能に近いことがわかっている。今回得たアポフェリチンの3次元像マップでは、トリプトファン側鎖の五員環に孔が空き、メチオニン側鎖の炭素原子と硫黄原子のサイズに明確な違いが見えるなど、その解像度は原子分解能に近いもので、生体分子水溶液試料の構造解析における原子分解能の達成にむけて、Cold FEGを装備したクライオ電子顕微鏡の極めて大きなポテンシャルを示した。

去年以来，利用冷冻电镜对鞭毛基体的结构分析取得了进一步进展，旨在阐明鞭毛运动的旋转机制。我们构建并完善了两种结构模型：在没有信号蛋白 CheY-P 的情况下仅逆时针旋转的野生型电机和仅顺时针旋转的突变型电机，并研究了旋转开关中涉及的结构变化。，我们揭示了电机转子核心部分跨膜蛋白FliF复合物的MS环，以及三种类型的膜蛋白FliP、FliQ、由 FliR 组成的 3 型鞭毛蛋白转运门的螺旋复合物，其顶部有五种类型的蛋白质 FliE、FlgB、FlgC、FlgF、FlgG 以螺旋形状聚合，以形成充当驱动轴的杆关于结构，他们通过以5 Å分辨率分析这个巨大复合物的整个结构，并结合每个组成蛋白的晶体结构和冷冻电子显微镜获得的高分辨率MS环结构，成功构建了分子模型。这两项结果目前正在以论文形式提交。利用冷冻电镜对心肌原肌球蛋白、肌钙蛋白和肌动蛋白纤维组成的细丝进行结构分析，首次构建了原肌球蛋白的全长分子模型，揭示了原肌球蛋白之间的连接结构，并揭示了构成原肌球蛋白的三种类型我们已经阐明了肌动蛋白亚基如何在多种肌动蛋白丝上结合在一起。我们还揭示了存在和不存在 Ca 离子时的两种状态结构，并阐明了支持肌肉收缩控制机制的结构变化。与该研究项目同步，我们自 2010 年起与 JEOL Ltd. 联合开发新型高度自动化冷冻电子显微镜 CRYO ARM，原型机于 2016 年夏季完成。 200（加速电压200 kV），我们从2017年夏天三天自动成像期间收集的约2,500张β-半乳糖苷酶电子显微镜图像（350,000个颗粒图像）中获得了2.4 Å的分辨率，但第一个商业产品CRYO ARM是2018 年 6 月在 RIKEN SPring-8 Center 引入并安装300 (300kV)，我们捕获了脱铁铁蛋白的球壳状结构的冷冻电镜图像，仅用一天自动拍摄的 840 张电镜图像（120,000 个粒子图像）就实现了 1.53 Å 的世界最高分辨率。该商用机配备了样机所没有的冷阴极场发射电子枪（Cold FEG），因此电子束的干扰较高，而且300kV的高加速电压也有助于电子的分辨率据了解，该光学系统的分辨率接近1.0 Å。此次获得的脱铁铁蛋白三维图像图中，分辨率接近原子分辨率，色氨酸侧链五元环有空洞，蛋氨酸侧碳、硫原子大小差异明显这证明了配备冷 FEG 的冷冻电子显微镜在水性生物分子样品结构分析中实现原子分辨率的巨大潜力。

项目成果

期刊论文数量（305）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

The unexpected role of polyubiquitin chains in the formation of fibrillar aggregates.

DOI：
10.1038/ncomms7116
发表时间：
2015-01-20
期刊：
NATURE COMMUNICATIONS
影响因子：
16.6
作者：
Morimoto, Daichi;Walinda, Erik;Fukada, Harumi;Sou, Yu-Shin;Kageyama, Shun;Hoshino, Masaru;Fujii, Takashi;Tsuchiya, Hikaru;Saeki, Yasushi;Arita, Kyohei;Ariyoshi, Mariko;Tochio, Hidehito;Iwai, Kazuhiro;Namba, Keiichi;Komatsu, Masaaki;Tanaka, Keiji;Shirakawa, Masahiro
通讯作者：
Shirakawa, Masahiro

A repeat unit of Vibrio diarrheal T3S effector subverts cytoskeletal actin homeostasis via binding to interstrand region of actin filaments.

DOI：
10.1038/srep10870
发表时间：
2015-06-03
期刊：
Scientific reports
影响因子：
4.6
作者：
Nishimura M;Fujii T;Hiyoshi H;Makino F;Inoue H;Motooka D;Kodama T;Ohkubo T;Kobayashi Y;Nakamura S;Namba K;Iida T
通讯作者：
Iida T

Novel Insights into Conformational Rearrangements of the Bacterial Flagellar Switch Complex

DOI：
10.1128/mbio.00079-19
发表时间：
2019-04
期刊：
mBio
影响因子：
6.4
作者：
Tomofumi Sakai;T. Miyata;Naoya Terahara;K. Mori;Y. Inoue;Yusuke V. Morimoto;Takayuki Kato;K. Namba;T. Minamino
通讯作者：
Tomofumi Sakai;T. Miyata;Naoya Terahara;K. Mori;Y. Inoue;Yusuke V. Morimoto;Takayuki Kato;K. Namba;T. Minamino

Determination of local pH differences within living Salmonella cells by high-resolution pH imaging based on pH-sensitive GFP derivative, pHluorin(M153R)

基于 pH 敏感 GFP 衍生物 pHluorin(M153R) 的高分辨率 pH 成像测定活沙门氏菌细胞内的局部 pH 差异