細菌べん毛の自己構築とスイッチ機構

细菌鞭毛的自组装和开关机制

基本信息

批准号：
04F04171
负责人：
難波啓一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04171/
关键词：
1分子計測(SMD)電子顕微鏡ナノバイオナノマシン分子モーター

项目摘要

細菌の運動器官であるべん毛は、20種類の蛋白質から構成される生体超分子で、回転モータである基部体、らせん繊維型プロペラとして働くフィラメント、そしてそれらを連結してユニバーサルジョイントとして働くフックと、おおまかに3つの部分からなる。べん毛フィラメントはフラジェリンが非共有結合でらせん状に重合したチューブ構造で、極低温電子顕微鏡像の画像解析による構造解析法の長年にわたる工夫によってその原子モデルの構築に成功した(Yonekura et al., Nature 2003)。フックの構造については、その直線型構造の低温電子顕微鏡像解析による低分解能立体像と、サブユニット蛋白質FlgEのX線結晶構造解析法による原子モデルを組み合わせ、機能構造である曲がったフックの擬似原子モデルを構築し、それに基づく分子動力学シミュレーションにより、ドメイン間相互作用表面で一定数の水素結合やファンデアワールス接触点を保ちつつ結合相手を順次替えて相互滑りを起こし、各素繊維が約30%にもおよぶ伸縮をしてユニバーサルジョイント機能を実現することを明らかにした。(Samatey et al.Nature 2004)Roland DEGENKOLBE研究員は、べん毛基部体の蛋白質であるFliMとFliN、そしてべん毛蛋白質輸送装置の基幹サブユニットFliIとFliHが形成する複合体について、電子顕微鏡とX線回折法を組み合わせた超分子立体構造解析手法によるその全体構造の解析をめざしている。この複合体はべん毛の自己構築過程で、輸送の効率化を計るための非常に大切な役割を果たしており、構造が解けて原子モデルが構築できれば、べん毛蛋白質輸送のしくみについて大きな手がかりが得られると予想され、大変楽しみな研究プロジェクトである。そこで、DEGENKOLBE研究員は、この複合体の構成蛋白質を共発現する大腸菌大量発現系を用いた蛋白質試料の調整法、精製法の工夫を行い、結晶化とX線結晶構造解析、そして電子顕微鏡による立体構造解析をめざした研究作業を着実に進めてきた。いくつかの条件で微小な結晶が結晶化ドロップに現れ、それを拾い上げて実験室のX線回折装置にかけて回折能を確認したが、まだ良好な回折像は得られていない。結晶化条件をさらに工夫することにより結晶をより大きく成長させ、高分解能の回折反射を観測できるよう日夜がんばっている。この種類の仕事はリスクが大きく、本来ならば、2年間のJSPS特別研究員の短い期間中に挑戦するのには多大な困難が予想されるが、DEGENKOLBE研究員はこの難しい問題に果敢に挑戦し、質の高い成果を上げようとしており、その姿勢は高く評価できる。

鞭毛是细菌的运动器官，是由20种蛋白质组成的生物超分子。它们由作为旋转马达的基体、作为螺旋纤维推进器的细丝以及连接它们并发挥作用的钩子组成。作为万向节，它大致由三部分组成。鞭毛丝具有管状结构，其中鞭毛蛋白通过非共价键聚合成螺旋状，通过多年来基于低温电子显微镜图像分析的结构分析方法的完善，成功构建了鞭毛丝的原子模型。米仓等人，《自然》，2003 年）。关于钩的结构，我们将通过冷冻电子显微镜图像分析获得的线性结构的低分辨率3D图像与通过亚基蛋白FlgE的X射线晶体结构分析获得的原子模型相结合，获得了拟原子结构弯曲的钩子，这是功能结构，建立一个模型并基于它的分子动力学。通过科学模拟，我们发现，在域间相互作用面上保持恒定数量的氢键和范德华接触点的同时，通过顺序改变键合伙伴而发生相互滑动，每个基本纤维膨胀和收缩约30%，从而产生据透露，将实现通用结构。 (Samatey et al.Nature 2004) 研究人员Roland DEGENKOLBE使用电子显微镜研究了鞭毛基体蛋白FliM和FliN以及鞭毛蛋白转运装置的核心亚基FliI和FliH形成的复合物，旨在分析其整体结构。采用超分子三维结构分析技术结合X射线衍射。这种复合物对于提高鞭毛自组装过程中的运输效率起着非常重要的作用，如果能够解析该结构并构建原子模型，将为了解鞭毛蛋白质运输机制提供重要线索。这是一个非常令人兴奋的研究项目，因为预计会产生重大成果。因此，研究人员DEGENKOLBE设计了一种利用大肠杆菌质量表达系统制备和纯化蛋白质样品的方法，该系统共表达该复合物的组成蛋白质，并使用电子显微镜进行结晶、X射线晶体结构分析和立体分析。针对结构分析的研究工作正在稳步推进。在某些条件下，结晶滴中会出现微小的晶体，将其拾取并置于实验室X射线衍射装置中检查其衍射能力，但尚未获得良好的衍射图像。我们夜以继日地努力工作，通过进一步改善结晶条件来生长更大的晶体，并能够观察高分辨率的衍射反射。这类工作风险很大，在JSPS研究金的短短两年时间内很难承担，但DEGENKOLBE研究员勇敢地承担了这个难题，他努力产出高质量的成果，他的态度。是非常值得称赞的。