硫黄転移系に依存する転写制御機構の解明

阐明依赖于硫转移系统的转录控制机制

基本信息

批准号：
09J03182
负责人：
秀瀬涼太
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

鉄硫黄クラスター(Fe/S)は、生物界に広く存在するコファクターであり、あらゆる生物にとって必須である。Fe/Sは化学反応の触媒や酸化還元反応の電子伝達体として機能するほか、遺伝子発現制御やタンパク質構造の安定化に関わるなど、その生体内における役割は多様である。Escherichia coliにはFe/Sをもつタンパク質が少なくとも100種以上存在すると推測されている。E.coliにおいて、Fe/S生合成に関わるタンパク質因子群としてiscオペロン(iscSUA-hscBA-fdx)にコードされるISC(iron-sulfur cluster)マシナリーが知られている。しかし、ISCマシナリーが関わるFe/S生合成機構の詳細は未だ不分明である。E.coli K12由来ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ(EcDPD)は、5,6-ジヒドロウラシル(DHU)をウラシルへ酸化する反応を触媒する鉄硫黄フラボタンパク質である。EcDPDは[2-^<14>C]DHUの核酸への取り込みに関与しており、[2-^<14>C]DHUの取り込みに伴う菌体の放射能の増加はEcDPD活性に依存する。研究代表者は[2-^<14>C]DHUの取り込みに伴う菌体の放射能の増加がEcDPD活性に依存する現象に着目し、Fe/S生合成の足場となるIscUの機能に必須なアミノ酸残基の同定をin vivoで初めて行った。IscUの欠損株に野生型IscUやFe/Sの結合に必須と考えられるアミノ酸残基を改変した変異型IscU (C37A, C63A, H105A, C106A, C37H, C63H, H105C, C106H)をコードするプラスミドを導入し、[2-^<14>C]DHUの取り込みに伴う各形質転換体の放射能の増加量を測定した。その結果、変異型IscUを導入した菌体では野生型IscUを導入した菌体と比べて低い放射能を示した。次に、それら各形質転換体のFe/Sタンパク質(グルタミン酸シンターゼ、EcDPD)の活性を測定したところ、変異型IscUを導入した菌体のFe/Sタンパク質の活性は野生型IscUを導入した菌体と比べて低い活性値を示した。これらの実験結果から、変異を導入したいずれのアミノ酸残基もIscUの機能に必須であることが示唆された。

铁硫簇 (Fe/S) 是生物界普遍存在的辅助因子，对所有生物体至关重要。除了充当化学反应的催化剂和氧化还原反应的电子载体之外，Fe/S 在生物体中发挥着多种作用，包括调节基因表达和稳定蛋白质结构。据估计，大肠杆菌中至少有100种含Fe/S的蛋白质。在大肠杆菌中，由 isc 操纵子 (iscSUA-hscBA-fdx) 编码的 ISC（铁硫簇）机制被称为一组参与 Fe/S 生物合成的蛋白质因子。然而，涉及 ISC 机制的 Fe/S 生物合成机制的细节仍不清楚。来自大肠杆菌 K12 的二氢嘧啶脱氢酶 (EcDPD) 是一种铁硫黄素蛋白，可催化 5,6-二氢尿嘧啶 (DHU) 氧化为尿嘧啶。 EcDPD参与将[2-^ 14 C]DHU掺入核酸中，并且与[2-^ 14 C]DHU掺入相关的细菌细胞放射性的增加取决于EcDPD活性。主要研究人员重点关注与[2-^ 14 C]DHU摄取相关的细菌放射性增加依赖于EcDPD活性的现象，并发现它对于IscU的功能至关重要，IscU充当支架Fe/S生物合成是首次在体内鉴定出独特的氨基酸残基。将编码具有被认为对于Fe/S结合必需的氨基酸残基进行修饰的野生型IscU或突变型IscU(C37A、C63A、H105A、C106A、C37H、C63H、H105C、C106H)的质粒添加到IscU缺陷菌株中。测量了由于[2-^ 14 C]DHU的掺入而导致的每个转化体放射性增加的百分比。结果，引入突变型IscU的细胞显示出比引入野生型IscU的细胞更低的放射性。接下来，我们测量了这些转化体中的Fe/S蛋白（谷氨酸合酶，EcDPD）的活性，结果发现，导入突变体IscU的细胞中的Fe/S蛋白活性高于导入突变体的细胞中的Fe/S蛋白活性。与导入野生型 IscU 的细胞相比，其活性值较低。这些实验结果表明所有突变的氨基酸残基对于 IscU 的功能都是必需的。