ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築と活性化機構の解析

乙酰肝素酶抑制剂搜索系统构建及激活机制分析

基本信息

批准号：
13218141
负责人：
清水史郎
金额：
$ 4.93万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218141/
关键词：
ヘパラナーゼヘパラン硫酸 mRNA DNAメチル化プロテインキナーゼC

项目摘要

本年度は、1.ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築、2.構築したアッセイ系を利用した阻害剤の同定、3.ヘパラナーゼmRNAの発現機構の解析、および4.ヘパラナーゼタンパク質の安定化、に関して検討を行った。1.ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築:HepG2細胞にヘパラナーゼ遺伝子を遺伝子導入した細胞を樹立し、その細胞抽出物を酵素源、市販のヘパラン硫酸を基質としてヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築を行った。2.構築したアッセイ系を利用した阻害剤の同定:上記アッセイ系を利用して、微生物二次代謝産物を用いたスクリーニングを行った結果,ヘパラナーゼ阻害剤としてRK-682を単離した。RK-682はin vitroにおいて約10μMの濃度でヘパラナーゼ活性を阻害した。また、ケミカル・ライブラリーを用いたスクリーニングでは4つの化合物がヘパラナーゼ阻害活性を示した。3.ヘパラナーゼmRNAの発現機構の解析:ヘパラナーゼの発現は正常組織で低く、がん組織で亢進している。様々な検討を行った結果,DNAのメチル化がヘパラナーゼの発現調節に間接的に関与していることを明らかにした。つまり、正常組織において、ある遺伝子のプロモーター領域がメチル化されているため、結果的にヘパラナーゼの発現が抑えられているが、がん組織においてはこのメチル化の程度が低いためにヘパラナーゼ遺伝子の発現が亢進している可能性が示唆された。4.ヘパラナーゼタンパク質の安定化:様々なタンパク質の安定化に関与しているプロテインキナーゼC(PKC)に着目し,ヘパラナーゼタンパク質の安定化に対する影響を検討した。その結果,PKC活性化剤のTPA処理によりヘパラナーゼタンパク質の安定化が誘導され、PKC阻害剤処理でヘパラナーゼタンパク質の減少が誘導された。

今年，我们研究了1.构建乙酰肝素酶抑制剂搜索系统，2.使用构建的检测系统鉴定抑制剂，3.分析乙酰肝素酶mRNA的表达机制，以及4.乙酰肝素酶Ta的稳定化。 1、乙酰肝素酶抑制剂检测体系的构建：将乙酰肝素酶基因转染HepG2细胞，以细胞提取物为酶源，市售硫酸乙酰肝素为底物，构建乙酰肝素酶抑制剂检测体系。 2.使用所构建的测定系统鉴定抑制剂：作为使用上述测定系统使用微生物次级代谢产物进行筛选的结果，分离出RK-682作为乙酰肝素酶抑制剂。 RK-682 在浓度约为 10 μM 时可抑制体外乙酰肝素酶活性。此外，在使用化学库的筛选中，四种化合物显示出乙酰肝素酶抑制活性。 3、乙酰肝素酶mRNA表达机制分析：正常组织中乙酰肝素酶表达较低，癌组织中表达升高。各种研究的结果表明，DNA甲基化间接参与乙酰肝素酶表达的调节。也就是说，在正常组织中，某个基因的启动子区域被甲基化，导致乙酰肝素酶表达受到抑制，但在癌组织中，甲基化程度较低，导致乙酰肝素酶基因表达可能存在差异。增加4.乙酰肝素酶蛋白的稳定化：我们关注参与多种蛋白质稳定化的蛋白激酶C（PKC），并研究其对乙酰肝素酶蛋白稳定化的影响。结果，用TPA（一种PKC激活剂）处理诱导了乙酰肝素酶蛋白的稳定，而用PKC抑制剂处理则诱导了乙酰肝素酶蛋白的减少。