ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築と活性化機構の解析

乙酰肝素酶抑制剂搜索系统构建及激活机制分析

• 批准号: 12217159
• 负责人: 清水 史郎
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12217159/
• 关键词: ヘパラナーゼ; HepG2細胞; WI-38細胞; RT-PCR法

ヘパラナーゼ活性化機構の解析を目的として、ヘパラナーゼmRNAの定量法をRT-PCR法で検討を行った。様々なプライマーの組み合わせを試行した結果,活性型ヘパラナーゼの全ての配列を含む条件で最適化することができた。この方法を用いて、様々なヒト培養細胞におけるヘパラナーゼの発現量を比較した結果,正常肺繊維芽細胞であるWI-38細胞においては発現量が低く、また、ほとんどの培養がん細胞では発現の亢進がみられた。しかし、肝細胞がん由来のHepG2細胞においてはその発現レベルが低く,正常細胞であるWI-38細胞と同程度であった。また、ヘパラナーゼ阻害剤の探索系に用いる酵素を過剰発現細胞から得るために,ヘパラナーゼ過剰発現細胞の樹立を試みた。最初にヒト肺がん細胞のA549細胞から、全長のヘパラナーゼ遺伝子のクローニングを行った。配列を確認後、C末端にMycとHisのタグをつけた哺乳類発現用ベクターにサブクローニングをした。現在、ヘパラナーゼ低発現細胞であるHepG2細胞に遺伝子を導入し,ヘパラナーゼ高発現細胞のクローン化を行っている。

为了分析乙酰肝素酶激活机制，我们研究了一种使用 RT-PCR 定量乙酰肝素酶 mRNA 的方法。通过尝试各种引物组合，我们能够优化条件以包含活性乙酰肝素酶的所有序列。利用这种方法，我们比较了各种培养的人类细胞中乙酰肝素酶的表达水平，发现在正常肺成纤维细胞WI-38细胞中表达水平较低，并且在大多数培养的癌细胞中表达水平较低。观察到增加。然而，源自肝细胞癌的HepG2细胞中的表达水平较低，并且与正常细胞WI-38细胞中的表达水平相当。此外，我们尝试建立乙酰肝素酶过表达细胞，以便从过表达细胞中获得用于乙酰肝素酶抑制剂搜索系统的酶。首先，从人肺癌A549细胞中克隆了全长乙酰肝素酶基因。确认序列后，将其亚克隆到C末端带有Myc和His标签的哺乳动物表达载体中。目前，我们正在通过将该基因导入表达低乙酰肝素酶的 HepG2 细胞来克隆表达高乙酰肝素酶的细胞。

项目成果

Y.Matsumoto, et at.: "Bcl-2-independent induction of apoptosis by neuropeptide receptor antagonist in human small cell lung carcinoma cells"Anticancer Res.. 20. 3123-3129 (2000)

Y.Matsumoto等人：“神经肽受体拮抗剂在人小细胞肺癌细胞中不依赖于Bcl-2诱导细胞凋亡”Anticancer Res. 20. 3123-3129 (2000)

S.Simizu & H.Osada: "Mutations in the Plk gene lead to instability of Plk protein in human tumour cell lines"Nature Cell Bioli.. 2. 852-854 (2000)

西米祖

S.Simizu, et al.: "Bcl-2 inhibits calcineurin-mediated Fas ligand expression in antitumor drug-treated baby hamster kidney cells"Jpn.J.Cancer Res.. 91. 706-714 (2000)

S.Simizu 等：“Bcl-2 抑制抗肿瘤药物处理的幼仓鼠肾细胞中钙调神经磷酸酶介导的 Fas 配体表达”Jpn.J.Cancer Res.. 91. 706-714 (2000)

M.Kawatani, et at.: "Involvement of protein kinase C-regulated ceramide generation in inostamycin-induced apoptosis"Exp.Cell Res.. 259. 389-397 (2000)

M.Kawatani 等人：“肌霉素诱导的细胞凋亡中蛋白激酶 C 调节的神经酰胺生成的参与”Exp.Cell Res.. 259. 389-397 (2000)

長田裕之 他: "進化する抗がん剤"化学と生物. 38. 799-803 (2000)

Hiroyuki Nagata 等人：“不断发展的抗癌药物”化学与生物学 38. 799-803 (2000)。