クロマチンリモデリングに関与するヘリカーゼによる転写調節ネットワーク

参与染色质重塑的解旋酶的转录调控网络

基本信息

批准号：
13206050
负责人：
河野憲二
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

RVB2/TIH2の高温感受性株を利用し、また酵母DNAマイクロアレイ法を用いることにより、RVB2/TIH2依存的に転写調節を受ける遺伝子群を網羅的に探索した。マイクロアレイを行った結果、Rvb2p/Tih2pが不活化すると転写が抑制されるもの、逆に転写が促進される遺伝子群があり、転写が抑制されるものの多くはΔino80でも転写が抑制されていた。一方転写が促進される遺伝子群はΔino80とは挙動を共にしなかった。これらの結果をノザン解析を行うことにより確認した。この結果から、RVB複合体はIno80複合体に含まれ転写を制御している場合と、Ino80とは別の形で転写を制御している場合とがあることが予想された。免疫共沈降実験により、Rvb2p/Tih2pとRvb1p/Tih1pとは複合体を形成していることがわかったが、さらにGST-RVB融合タンパク質を作製し、GST pull-down実験を行うことにより、Rvb1pとRvb2pとが直接結合している可能性が高いことが明らかとなった。また、同様な免疫沈降実験によりRVB複合体とTBPとは相互作用していることが判明した。TBPとRVB2との2重変異株を作製すると、29℃での細胞の生育ができなくなる合成効果がみとめられ、両者が遺伝的にも関連していることが裏付けられた。面白いことに、この効果はTBPのアレルに特異的であり、その部位とRVB複合体とが相互作用している可能性がでてきた。現在、RVB複合体に含まれる個々のタンパク質を、MALDI-TOFを用いて解析しており、新しいタンパク質が同定されつつある。今後は、これらのタンパク質が転写制御にどのような役割を持つかを調べるとともに、標的遺伝子が明らかになったので、その転写制御に実際にRVB1/TIH1,RVB2/TIH2が関わっているのかどうかを種々の方法で確認していきたい。

通过使用RVB2/TIH2高温敏感菌株和酵母DNA微阵列方法，我们全面寻找以RVB2/TIH2依赖性方式转录调控的基因。微阵列分析表明，当Rvb2p/Tih2p失活时，有些基因的转录被抑制，相反，有些基因的转录被促进，并且许多转录被抑制的基因也被Δino80抑制。另一方面，转录被促进的基因的行为方式与Δino80不同。这些结果通过 Northern 分析得到证实。根据该结果，预测RVB复合体可能包含在Ino80复合体中并在某些情况下调节转录，或者以与Ino80分离的方式调节转录。免疫共沉淀实验显示Rvb2p/Tih2p和Rvb1p/Tih1p形成复合物，但通过进一步产生GST-RVB融合蛋白并进行GST Pull-down实验，发现Rvb2p/Tih2p和Rvb1p/Tih1p形成复合物很明显，它很可能直接与 Rvb2p 结合。此外，类似的免疫沉淀实验表明 RVB 复合物和 TBP 相互作用。当TBP和RVB2的双突变菌株被创建时，观察到合成效应使细胞无法在29°C下生长，这支持了两者在遗传上相关。有趣的是，这种效应是 TBP 等位基因特有的，增加了该区域与 RVB 复合体相互作用的可能性。目前，正在使用 MALDI-TOF 分析 RVB 复合物中包含的单个蛋白质，并正在鉴定新的蛋白质。未来我们会研究这些蛋白在转录调控中的作用，现在靶基因已经确定了，我们会研究RVB1/TIH1和RVB2/TIH2是否真的参与转录调控，我想证实这一点。使用各种方法。