ジストロフィンmRNA前駆体のスプライシングに関与する新規タンパクのクローニング

克隆参与肌营养不良蛋白前体 mRNA 剪接的新型蛋白质

• 批准号: 12877124
• 负责人: 松尾 雅文
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877124/
• 关键词: ジストロフィン; スプライシング; RNA結合蛋白; 核タンパク; 核抽出液

ジストロフィンmRNA前駆体のスプライシングに関与する未知の核内タンパクが存在するとの説が提唱され注目されている。しかし、ジストロフィンのスプライシングを特異的に制御するタンパクに関する研究はなく、ジストロフィン異常症研究の未開拓領域として残されたままで、先の説も証明されていない。本研究は、ジストロフィンのスプライシングに関与する核タンパクを世界に先駆けてクローニングするものである。先に私たちはジストロフィン遺伝子のエクソン19の配列内にスプライシング促進配列があり、この配列がスプライシングを制御していることを明らかにしてきた。その制御にはこのスプライシング促進配列に結合するタンパクが大きく関与していることが疑われたので、RNA結合タンパクの精製とその遺伝子のクローニングを行った。スプライシング促進配列からなるFITCでラベルしたRNAを合成し、これに結合する核タンパクをまず精製した。HeLa細胞核抽出液をアニオン交換カラムカラムと逆相カラムにかけスプライシング促進配列に結合するタンパクをアクリルアミド電気泳動上単一のバンドまで精製した。そして、精製した蛋白をマススペクトメトリー解析したが、そのスペクトルパターンに該当するタンパクをコードしている遺伝子は発見されなかった。そこで、先に精製したタンパクをトリプシン処理して断片化した後、それぞれの断片のアミノ酸配列をペプチドシークエンサーで解析した。その結果、精製したタンパクの一部のアミノ酸配列を明らかにすることに成功した。この1部のアミノ酸配列はデータベース内の遺伝子によりコードされているタンパクの一部の配列であり、RNA結合タンパクのクローニングに成功した。現在明らかになったcDNA配列をもとにタンパクを発現させ、その機能を解析すべく準備を進めている。

抗肌营养不良蛋白前体 mRNA 剪接中存在一种未知的核蛋白参与的理论已被提出，并引起了人们的关注。然而，目前还没有专门控制肌营养不良蛋白剪接的蛋白质的研究，这仍然是肌营养不良蛋白紊乱研究的一个未探索的领域，之前的理论也没有得到证实。这项研究是世界上第一个克隆参与肌营养不良蛋白剪接的核蛋白的研究。我们之前已经证明，肌营养不良蛋白基因的外显子 19 内有一个剪接促进序列，并且该序列控制剪接。我们怀疑与该剪接促进序列结合的蛋白质在很大程度上参与了其调节，因此我们纯化了RNA结合蛋白并克隆了其基因。合成了由剪接促进序列组成的 FITC 标记的 RNA，并首先纯化与其结合的核蛋白。将 HeLa 细胞核提取物应用于阴离子交换柱和反相柱，以纯化与剪接促进序列结合的蛋白质，使其在丙烯酰胺凝胶电泳上形成单条带。然后通过质谱分析纯化的蛋白质，但没有发现编码与光谱模式相对应的蛋白质的基因。因此，通过胰蛋白酶处理将先前纯化的蛋白质片段化，然后使用肽测序仪分析每个片段的氨基酸序列。结果，他们成功揭示了部分纯化蛋白质的氨基酸序列。这部分氨基酸序列是数据库中该基因编码的部分蛋白质的序列，RNA结合蛋白克隆成功。目前正在准备根据目前揭示的 cDNA 序列表达该蛋白质并分析其功能。