ジストロフィンmRNA前駆体のスプライシング促進配列に結合する核タンパクに関する研究

抗肌营养不良蛋白前体mRNA剪接促进序列结合核蛋白的研究

• 批准号: 02F00252
• 负责人: 松尾 雅文
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00252/
• 关键词: DMD; dystrophin; splicing; RNA binding protein

ジストロフィン遺伝子から転写されたmRNA前駆体は100kb以上もの巨大イントロンを有しており、そのスプライシングは非常に精密に制御されているものと考えられる。しかし、その機構を分子細胞生物学的手法を用いて明らかにした報告はない。本研究は、ジストロフィンmRNA前駆体に結合する核タンパクを分離精製し、その遺伝子をクローニングするとともに、発現させたタンパクを用いてスプライシング制御機序を明らかにするものである。ジストロフィン遺伝子の79のエクソンの中でエクソン19にスプライシング促進配列があることが明らかにされている。本研究では、まずエクソン19のスプライシング促進配列に結合する核タンパクの分離精製を行った。31塩基からなるエクソン19のスプラシシング促進配列からなるFAMラベルしたRNAプローブを作製した。これをHeLa細胞核抽出液と混ぜRNA・タンパク複合体をUVクロスリンク法を用いて作製した。さらに、HPLC法と電気泳動法を用いてこの複合体を単一バンドになるまで精製した。そして、この精製したバンドをTOFMAS分析し、プローブに結合した核タンパクの一部のアミノ酸配列を直接明らかにし、その結果からスプライシング促進配列に結合するタンパクの同定に成功した。この分離精製したタンパクのcDNAの全長をスクリーニングし、これをタンパク発現ベクターに組み込んだ。現在、本タンパク質の機能解析をミニ遺伝子を導入したHeLa細胞を応用した分子生物学的手法を用いて行っている。

由肌营养不良蛋白基因转录的前体 mRNA 具有超过 100 kb 的大内含子，其剪接被认为受到极其精确的调控。然而，还没有利用分子细胞生物学技术阐明其机制的报道。在本研究中，我们将分离和纯化与肌营养不良蛋白前体mRNA结合的核蛋白，克隆该基因，并利用表达的蛋白阐明剪接控制机制。研究表明，肌营养不良蛋白基因79个外显子中的第19号外显子含有剪接促进序列。在本研究中，我们首先分离并纯化了与外显子19剪接促进序列结合的核蛋白。制备由31个碱基的外显子19剪接促进序列组成的FAM标记的RNA探针。将其与 HeLa 细胞核提取物混合，并使用 UV 交联方法创建 RNA/蛋白质复合物。使用 HPLC 和电泳将该复合物进一步纯化为单条带。利用TOFMAS分析该纯化条带，他们直接揭示了与探针结合的核蛋白部分的氨基酸序列，并从结果中成功鉴定了与剪接促进序列结合的蛋白质。筛选该分离纯化蛋白质的全长 cDNA，并将其整合到蛋白质表达载体中。我们目前正在使用导入了小基因的 HeLa 细胞，通过分子生物学方法分析该蛋白质的功能。