光によるリアルタイム蛋白質不活化法を用いた神経-グリア相互作用新規解析法の開発

开发一种利用光实时蛋白质失活来分析神经元-胶质细胞相互作用的新方法

基本信息

批准号：
20659039
负责人：
櫻井隆
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659039/
关键词：
神経科学プロテオーム組換え抗体

项目摘要

神経細胞とグリア細胞は近接・接着部位に受容体、チャネル、トランスポーターなどの膜機能分子を集積し、相互に情報伝達や機能調節を行っている。その機能は多岐にわたり複雑な細胞形態・組織構築を背景にしているため、関連分子の探索・解析のためには相互作用している場において直接機能解析を行う新しいアプローチが必要とされている。我々が開発した蛍光色素標識抗体と光照射により特定の蛋白質を生細胞において不活性化するFluorophore-assisted light inactivation(FALI)は、このような解析に有用な研究方法と考えられる。本研究は、抗体ライブラリーを用いたFALIにより機能変化を起こす抗体クローンを選択することで新規の機能分子を探索する手法を神経・グリア細胞の膜ラフト集積蛋白質に応用するための基盤技術開発を目的としている。本年度は、1) 昨年度準備したボスホパンテテイニルトランスフェラーゼによる抗体のポストラベルの標識条件・効率を検討した。蛍光色素標識のためには高濃度の基質を必要とし効率的にも劣ることが明らかとなったため、組換え抗体のin vitro翻訳時にフルオレセインを導入する方法を検討中である。これまで実績のあるβガラクトシダーゼを標的とした実験を進めている。2) 抗体を介さずに細胞表面発現膜蛋白質に直接蛍光色素を導入して細胞を用いたFALIのコントロール実験を行うために、株化細胞、初代培養神経細胞における蛍光標識を行った。トランスフェクションにより培養細胞にSNAP, CLIPなどのポストラベル用タグを融合させた膜蛋白質を発現させ、細胞表面における蛍光標識の条件を検討した。モデル系を用いて標的蛋白質の不活性化を確認し、探索に適用するための条件設定を行う。

神经元和神经胶质细胞在接近和粘附位点积累膜功能分子，例如受体，通道和转运蛋白，并传达信息并相互调节功能。由于其功能是多样化且复杂的细胞形态和组织构建，因此需要一种新的方法来直接分析相互作用领域的功能分析，以搜索和分析相关分子。我们开发了荧光团辅助光灭活（FALI），它通过用荧光染料标记的抗体来使活细胞中的特定蛋白质失活，被认为是一种有用的研究方法。这项研究旨在开发基本技术，以应用一种方法，通过选择使用抗体文库使用FAI进行功能变化的抗体克隆，通过选择抗体克隆来探索新型功能分子的膜积累蛋白。今年，1）我们研究了去年制备的boss耐乙基转移酶的标签后标记条件和效率。已经发现，荧光染料标记需要高浓度的底物并且效率较低，因此目前正在考虑重组抗体的体外翻译过程中引入荧光素的一种方法。我们目前正在进行针对β-半乳糖苷酶的实验，该实验已验证了良好的记录。 2）为了通过直接将荧光染料引入细胞表面表达膜蛋白而无需使用抗体，将荧光染料直接引入荧光染料，将荧光染料引入细胞表面的细胞表面，并将原发性培养神经元引入荧光标记，并将荧光染料引入荧光染料。进行转染以表达膜蛋白，其中标签后标签（例如SNAP和夹子）融合到培养的细胞中，并检查了细胞表面上荧光标记的条件。使用模型系统，确认目标蛋白的失活，并将条件设置为搜索。