RNAポリメラーゼI発現系を利用したC型肝炎ウイルス増幅系の開発

利用RNA聚合酶I表达系统开发丙型肝炎病毒扩增系统

• 批准号: 20659012
• 负责人: 近藤 昌夫
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659012/
• 关键词: C型肝炎ウイルス; 長鎖RNA; RNA polymerase I; RNA polymerasa I

現在、C型肝炎に対する治療法はインターフェロン(免疫賦活化)およびリバビリン(ウイルス複製阻害)の併用療法しかなく、この治療法ですら奏効率は50%に過ぎない。C型肝炎ウイルス(HCV)はチンパンジーにしか感染せず、マウスなどの小動物を用いたin vivo HCV感染系が未開発だったこと、効率的なHCV増幅系が存在しないことが、C型肝炎治療薬創製を困難なものにしていた。最近、ヒト肝臓キメラマウス作製技術が開発され、ようやくマウスを利用したin vivo HCV感染系の目途が立ったものの、依然として効率的なHCV増幅系は開発されていない。以上の背景を踏まえ、本課題では、長鎖RNA発現系RNA polymerase I発現カセットを搭載したアデノウイルス(Ad)ベクターを作製し、HCV RNA genomeをキメラマウスの肝臓に直接導入する技術を創出することにより、in vivoにおいてHCVを効率的に増幅するシステムを確立することを最終目的としている。前年度までの検討で、HCV rep Luc(HCV複製をluciferase遺伝子発現で解析可能)を搭載したAdベクターの作製を試みたところ、ウイルス粒子を作製できなかった。そこで本年度は、まず発現制御型のAdベクターを開発した。次に、本ベクターにHCV rep Lucを搭載したところ、Adベクター粒子が産生され、本ベクター感染細胞ではluciferase発現が観察され、インターフェロン添加によりluciferase発現量は濃度依存的に低下した。以上現在までに、Adベクターを利用したHCV複製評価系の構築に成功している。今後は、本ベクターを用いて、HCV克服に向けて基礎研究および創薬研究を遂行してく予定である。

目前，丙型肝炎的唯一治疗方法是干扰素（免疫刺激）和利巴韦林（病毒复制抑制）的组合，即使是这种治疗方法也只有50％的缓解率。丙型肝炎病毒（HCV）仅感染黑猩猩，而使用小鼠（例如小鼠）的体内HCV感染系统则未开发，并且缺乏有效的HCV扩增系统，因此难以开发用于丙型肝炎治疗的药物。最近，已经开发了用于生产人肝脏嵌合小鼠的技术，尽管最终使用小鼠的体内HCV感染有前景，但尚未开发出高效的HCV扩增系统。考虑到上述背景，该主题的最终目标是建立一个系统，该系统通过创建配备有长链RNA RNA表达系统RNA聚合酶I表达盒的腺病毒（AD）矢量来有效放大体内HCV，并创建一项技术直接将HCV RNA基因组直接引入of chimimeric Meice小鼠的肝脏中。在上一年的研究中，我们试图创建配备HCV REP LUC的AD矢量（可以通过荧光素酶基因表达来分析HCV复制），但我们无法产生病毒颗粒。因此，今年我们首先开发了一个表达式控制的AD载体。接下来，当将HCV REP LUC安装在该载体上时，会产生AD载体颗粒，并在感染该载体的细胞中观察到荧光素酶表达，荧光素酶表达水平通过添加干扰素以浓度依赖性方式降低。迄今为止，我们已经成功地使用了AD向量构建了HCV复制评估系统。将来，我们计划使用该矢量进行基础研究和药物发现研究，以克服HCV。

项目成果

Development of a conventional assay system for HCV replicationusing RNA polymerase I-dependent expression plasmid

使用 RNA 聚合酶 I 依赖性表达质粒开发 HCV 复制的常规检测系统

• 发表时间: 2008
• 作者: Yoshida T;Ojima M;Kondoh M;Yagi K
• 通讯作者: Yagi K

miR-122a-regulated expression of a suicide gene prevents hepatotoxicity without disturbing the antitumor effects in suicidegene therapy

自杀基因治疗中miR-122a调节的自杀基因表达可预防肝毒性而不干扰抗肿瘤作用

• 发表时间: 2008
• 期刊: Mol Ther 16
• 作者: Suzuki T;Sakurai F;Nakamura S-I;Kouyama E;Kawabata K;Kondoh M;Yagi K;Mizuguchi H
• 通讯作者: Mizuguchi H

Preparation of a controllable RNA polymerase I-dependent expression vector

可控RNA聚合酶I依赖性表达载体的制备

• 发表时间: 2009
• 作者: Takeshi Yoshida;Manabu Ojima;Masuo Kondoh;Hiroyuki Mizuguchi;Kiyohito Yagi
• 通讯作者: Kiyohito Yagi

増殖性ウイルスが出現しないアデノウイルスベクター作製法の開発

开发不产生复制病毒的腺病毒载体生产方法

• 发表时间: 2009
• 作者: 矢野小代里;鈴木孝幸;佐々木朋美;櫻井文教;川端健二;近藤昌夫;八木清仁;水口裕之
• 通讯作者: 水口裕之

転写制御型RNA polymerase I 発現系ベクターの創製

转录控制的RNA聚合酶I表达系统载体的创建

• 发表时间: 2009
• 作者: 吉田孟史;尾島学;磯田勝広;近藤昌夫;水口裕之;八木清仁
• 通讯作者: 八木清仁