がん細胞の悪性化を阻害する物質の探索

寻找抑制癌细胞恶变的物质

• 批准号: 00J60902
• 负责人: 和田 俊一
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J60902/
• 关键词: TPU0015A; DLD-1; リボゾームS6サブユニット; caspase 3; p27; ERK; IkB; TPU2013

前年度に引き続き、糸状菌由来テルペノイドTPU0015Aのがん細胞足場非依存的増殖阻害作用機構の解析を行った。TPU0015Aにより処理を行った大腸がん由来DLD-1細胞における各種癌遺伝子およびアポトーシス関連遺伝子の発現量の変化、リン酸化状態の変化をウェスタンブロッティングにより解析した。前年度までに見られたリボゾームS6サブユニットのリン酸化の向上やcaspase 3の活性化に加え、TPU0015A処理細胞において、p27の発現量やERKのリン酸化の上昇およびIkBのリン酸化量の減少が見られた。また、抗リン酸化PKA基質抗体を用いたタンパク質リン酸化の検出パターンにもいくつかの変化が見られた。こうした解析に並行して、本年度は新たにTPU0015Aの直接的な標的となるタンパク質を同定するための実験を行った。本物質自体は、生産菌からの収量が限られるため、まず大量に化学合成することができ、活性を保持する類縁体を用意することとした。足場存在下の細胞への毒性も高まったものの、TPU2008、TPU2009、TPU2013などにTPU0015Aと類似した活性が見られた。このうちTPU2013を用いて以降の実験を行うこととした。本化合物群の構造中、側鎖部位が最も活性への関与が低いことが予想されたことから、この部位をビオチン化したTPU2013を用意した。DLD-1細胞抽出液中にビオチン化TPU2013を加え、ストレプトアビジン結合セファロースによって沈殿させる方法で、TPU2013結合タンパク質の探索を行ったところ、約45kDaおよび約60kDaのタンパク質の特異的な結合が見られた。

继去年的基础上，我们分析了丝状真菌来源的萜类化合物TPU0015A抑制癌细胞贴壁依赖性生长的机制。通过Western blotting分析经TPU0015A处理的结直肠癌来源的DLD-1细胞中各种癌基因和凋亡相关基因的表达水平和磷酸化状态的变化。除了前一年观察到的核糖体 S6 亚基磷酸化的改善和 caspase 3 的激活之外，TPU0015A 处理的细胞还显示 p27 表达增加、ERK 磷酸化和 IkB 磷酸化减少。 。此外，使用抗磷酸化 PKA 底物抗体检测蛋白质磷酸化模式时观察到了一些变化。在进行这些分析的同时，今年我们进行了新的实验来鉴定作为 TPU0015A 直接目标的蛋白质。由于这种物质本身从生产细菌中的产量是有限的，我们决定首先制备一种可以大量化学合成并保留其活性的类似物。 TPU2008、TPU2009和TPU2013表现出与TPU0015A相似的活性，尽管支架存在下对细胞的毒性也增加。其中，我们决定使用TPU2013进行后续实验。在这组化合物的结构中，预计侧链位点参与活性最少，因此制备了TPU2013，其中该位点被生物素化。当通过将生物素化的 TPU2013 添加到 DLD-1 细胞提取物中并用链霉亲和素缀合的琼脂糖沉淀来寻找 TPU2013 结合蛋白时，观察到大约 45 kDa 和大约 60 kDa 的蛋白质的特异性结合。

项目成果

Shun-ichi Wada, Sachi Sri Kantha, Takahiro Yamashita, Shigeki Matsunaga, Nobuhiro Fusetani, Shugo Watabe: "Accumulation of H^+ in vacuoles induced by a marine toxin, theonellamide F, in rat embryonic 3Y1 fibroblasts"Marine Biotechnology. 4. 571-582 (2002)

Shun-ichi Wada、Sachi Sri Kantha、Takahiro Yamashita、Shigeki Matsunaga、Nobuhiro Fusetani、Shugo Watabe：“在大鼠胚胎 3Y1 成纤维细胞中，海洋毒素 Theonellamide F 诱导的液泡中 H^ 的积累”海洋生物技术。

Shun-ichi Wada, Masakazu Niimi, Kyoko Niimi, Ann R.Holmes, Brian C.Monk, Richard D.Cannon, Yoshimasa Uehara: "Candida glabrata ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Pdh1p expressed in Saccharomyces cercvisiae strain deficient in membrane transporter

Shun-ichi Wada、Masakazu Niimi、Kyoko Niimi、Ann R.Holmes、Brian C.Monk、Richard D.Cannon、Yoshimasa Uehara：“光滑念珠菌 ATP 结合盒转运蛋白 Cdr1p 和 Pdh1p 在膜转运蛋白缺陷的酿酒酵母菌株中表达