遺伝子治療を目指した膜透過・チャンネル形成ペプチドのベクターとしての可能性

膜穿透和通道形成肽作为基因治疗载体的潜力

基本信息

  • 批准号:
    14771267
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.11万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2002 至 2003
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

遺伝子治療における遺伝子導入ベクターの開発を目的として本研究を行なった.1.ペプチドベクターのデザインと合成,アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)の細胞内導入の検討チャンネル形成,膜透過機能を有する部位と静電的にオリゴヌクレオチドと結合する塩基性リンカー部位をデザインし,7種類のペプチド(P-1〜P-7)をFmoc固層合成法で合成した.P-1:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-2:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-3:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-4:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH;P-5:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-G-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-6:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-7:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH.蛍光ラベル化-AON/ペプチドを種々のモル比でプレインキュベーションし複合体を形成させ,AON/ペプチド複合体をNIH3T3,A549細胞に投与した.37℃,2hrインキュベーションした後,共焦点レーザー顕微鏡でAONの細胞内移行性及び細胞内分布を,フローサイトメーターで導入率を検討した.また,AON/ペプチド複合体の細胞毒性を乳酸脱水素酵素(LDH)の漏出を測定することにより行なったNIH3T3細胞では,AON/PI=1/10〜1/15の間で,AON/P7=1/10でLDHの漏出なしにAONの膜透過性が認められ,細胞質,核への分布が観察された.しかし導入率の点においては,リポソームベクターであるlipofectamineより低かった.またこの現象は,エンドサイトーシスが抑制される低温条件下でもAONの膜透過性が観察された.他のペプチドにおいては,AONの膜透過性は認められなかった.一方,A549細胞においては,すべてのペプチドで細胞毒性のない範囲内でのAONの細胞内への移行が観察されなかった.2.物理化学的手法を用いたAON透過機構の解明AON透過機構解析の基礎的な知見として,溶液中,リポソーム中でのP1,P7のコンフォメーション解析をCDスペクトルを用いて検討した.溶液中においては,両ペプチドともランダムコイル状態,一方リポソーム中ではヘリックス構造に変化することがわかった.3.総括:本ペプチドが従来のベクターとは異なったメカニズムでAONの細胞内導入を可能にしたことは,アンチセンス療法の発展に寄与できる可能性があると考えられる.
本研究的目的是开发用于基因治疗的基因转移载体。 1.肽载体的设计和合成,反义寡核苷酸(AON)的细胞内引入、通道形成、具有膜渗透功能的位点和静态A基本接头的研究。设计了与寡核苷酸电结合的位点,并设计了七种类型的肽(P-1至P -7)采用Fmoc固相合成法合成。P-1:Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K-OH;P-2:A c-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-3:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-K-K-K-K-K -K-K-K-K-K-OH;P-4:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U-P-K-S-K-R-K-V-OH;P-5:Ac-U-U-U-U-U-U-U-U -G-NH(CH_2)_2N(CH_3)_2;P-6:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-NH(CH_ 2)_2N(CH_3)_2;P-7:Ac-U-A-U-A-U-A-Q-U-L-U-G-U-U-P-V-U-B-E-Q-F-K-K-K-K-K-K-K-K -K-K-OH。荧光标记-AON/肽以不同摩尔比预孵育形成复合物,并将AON/肽复合物转移至NIH3T3、A549细胞。 37°C孵育2小时后,使用共聚焦激光显微镜检查AON的细胞内迁移和细胞内分布,并使用流式细胞仪通过测量乳酸脱氢酶(LDH)泄漏、AON来检查NIH3T3细胞中的导入率。 /PI=1/10 至 1/15在AON/P7=1/10时,观察到AON的膜通透性,没有LDH渗漏,并且观察到分布到细胞质和细胞核。然而,在转染率方面,脂质体载体lipofectamine,这一现象也表明,即使在内吞作用受到抑制的低温条件下,也观察到 AON 的膜通透性。在A549 细胞中未观察到AON 的膜渗透性。另一方面,在A549 细胞中,所有肽在非细胞毒性范围内均未观察到AON 的细胞内转移。 AON渗透机理分析的基础知识是溶液和脂质体中P1和P7的构象分析。使用CD光谱进行分析,发现两种肽在溶液中均呈无规卷曲状态,而在脂质体中则变为螺旋结构。 3.总结:该肽具有与常规载体不同的能力。通过这种机制进入细胞可能有助于反义疗法的发展。

项目成果

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专利数量(0)
和田俊一: "A Novel II-residual Peptaibol-Derived Carrier Peptide for in vitro Oligodeoxynucleotide Delivery into Cell"Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 14・10. 2563-2566 (2004)
Shunichi Wada:“用于体外寡脱氧核苷酸递送到细胞中的新型 II 残留 Peptaibol 衍生载体肽”生物有机与药物化学快报 14・10(2004 年)。
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  • DOI:
  • 发表时间:
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    0
  • 作者:
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    和田 俊一
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