放線菌における真核生物型リン酸化を介したグローバルな二次代謝制御機構の解明

阐明放线菌真核磷酸化介导的整体次级代谢控制机制

• 批准号: 08J06478
• 负责人: 田中 晶子
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J06478/
• 关键词: 放線菌; 真核生物型リン酸化; 二次代謝制御; マルチドメイン

放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)におけるAfsK/AfsR/AfsS制御系の機構全貌の解明を最終目標とし、その中心的役割を果たすマルチドメインタンパク質AfsRの機能解明を本研究の目的とする。S.coelicolor A3(2)の二次代謝をグローバルに制御する転写因子AfsRは真核生物型Ser/ThrキナーゼAfsKによってリン酸化されることでその活性が上昇することから、AfsRの機能に重要なリン酸化部位を決定し、恒常的活性化状態となる変異型AfsRの解析を行うことで、リン酸化とAfsRの機能との関わりを明らかにすることを目指した。本年度に実施した研究により、以下の成果が得られた。前年度におけるin vivoの解析によりリン酸化部位と考えられたThr残基にGluあるいはAsp変異を導入し、恒常的活性化状態であると考えられる変異型AfsRについて、リン酸化を受けていない野生型AfsRと比べてどのような機能の違いがあるか調べた。297番Thrや536番Thrに変異をもつAfsRに対しATPase活性の測定を行ったところ、これらの変異はATPase活性には大きな影響を与えないことが示された。また、これらの変異はDNA結合にも影響がなかった。一方、ゲルろ過クロマトグラフィーによりAfsRタンパク質の溶液中における状態を調べた。野生型AfsRは殆どが単量体で存在し、二量体が僅かに存在しているのに対して、297番目あるいは536番目のThr残基を酸性アミノ酸残基に置換した変異型AfsRでは、全体の1～3割が溶液中で二量体になることが示された。この結果は、これらの部位のリン酸化によってAfsRは二量体化しやすくなることを示唆しており、これがAfsR活性化の原因である可能性が考えられた。

最终目标是阐明放线菌链霉菌链霉菌A3（2）中AFSK/AFSR/AFSS调节系统的整个机制，这项研究的目的是阐明多域蛋白AFSR的功能，该蛋白AFSR在这项研究中起着核心作用。由于转录因子AFSR在全球范围内调节了Coelicolor A3（2）的继发代谢，因此由真核SER/THR激酶AFSK磷酸化，其活性增加。因此，我们旨在确定对AFSR功能很重要的磷酸化位点，并分析在组成型激活状态下的突变体AFSR，并阐明磷酸化与AFSR功能之间的关系。今年进行的这项研究取得了以下结果：在上一年的体内分析，将GLU或ASP突变引入了被认为是磷酸化位点的THR残基中，并且我们研究了与Wild-type Afsrs相比，这些突变型AFSR的功能差异，这些突变型AFSR的功能差异被认为是在强度激活状态中的。当在THR 297和THR 536中使用突变的AFSR上测量ATPase活性时，表明这些突变对ATPase活性没有显着影响。此外，这些突变不影响DNA结合。同时，通过凝胶过滤色谱法检查了溶液中AFSR蛋白的状态。虽然大多数野生型AFSR存在于单体中，并且仅存在少数二聚体，但在突变体AFSR中，位置297或536的THR残基被酸性氨基酸残基代替，但表明总计的10％至30％是溶液中的二聚体。该结果表明，这些位点的磷酸化使AFSR更易于二聚化，这可能是AFSR激活的原因。

项目成果

放線菌 Streptomyces coelicolor A3(2)の二次代謝を制御する転写因子AfsRの被リン酸化部位に関する解析

天蓝色链霉菌 A3(2) 中控制次生代谢的转录因子 AfsR 的磷酸化位点分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 三宅雅人;他;田中晶子
• 通讯作者: 田中晶子