ヘルパーエピトープを含むマルチエピトープアプローチによる新規癌ワクチン治療の開発

使用包括辅助表位在内的多表位方法开发新型癌症疫苗治疗

基本信息

批准号：
23591968
负责人：
伊藤剛
金额：
$ 3.41万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-23591968/
关键词：
腫瘍免疫学癌ワクチン療法

项目摘要

EV法による免疫後のCTL反応を詳細に検討するために、モデル抗原としてOVA蛋白由来のKb拘束性エピトープであるSIINFEKLをコードする遺云子を合成した後、これを組み込んだプラスミドを作製した。プラスミドは哺乳動物由来の細胞で発現し得るpcDNA3(Invitrogen社)を用いた。ワクチンは以下の方法で行った。まず、プラスミド200μgを全身麻酔下のマウス(C57BL/6)両大腿四頭筋内に半分づつ注射する。その後同注射部位にin vivoエレクトロポレーションを行う(BTX社ECM830)。2-Needle Array Elect rodeを注射部位をはさんで挿入して、100V,50msec,6pulsesの設定で通電を行う(一度re-poleを行い計2回通電)。免疫回数を1回と2回で比較する。免疫後7日、14日、21日の3タイムポイントでマウスを儀死させ、所属リンパ節と脾臓を採取する。CD8+T細胞中のCTL細胞数をKb/SIINFEKLテトラマー(PE conjugated)(Coulter社製)で検出する。テトラマーによる染色は同時に抗ClassII/FITC抗体、抗CD8/PerCP抗体を用いて行い、FACSCaliburで解析する。テトラマーのみの評価では実際の殺細胞効果の検討を行うことができないので、各タイムポイントにおける機能面の解析をin vivo cytotoxic assay法で行う。同アッセイの方法は、同系マウス(CD90.1発現,BL6PLマウス)から採取した同種脾細胞を2群にわけ、一方に高濃度(50mM)CFSE染色を、他方に低濃度(5mM)CFSE染色を施した後、高濃度染色群のみペプチドパルスを行っておく。そして2群の細胞数を同数づつ混ぜ合わせたものを尾静脈から経静脈投与し、48時間後に回収した脾臓から、細胞浮游液を調整して、その中に存在する両群の細胞数の比を取って、殺細胞効果を検討する。免疫されたマウスでは誘導されるCTLによって、高濃度群(ペプチドパルス群)の細胞が殺傷される事により、相対的に低濃度群の細胞が増加する。結果としては、モデル抗原であるOVA特異的な免疫反応を確認する事ができた。In vivo cytotoxic assayではコントロール群と比較して優位な殺細胞効果を確認する事ができた。次のステップとしては以下の実験を順次行って行く予定である。OVAに由来するMHCクラスII拘束性ペプチドであるOVA_<323-339>(ISQAVHAAHHAEINEAGR)をコードするプラスミドを同様に作製してマウスを免疫し、ヘルパーT細胞の活性を測定する。測定には免疫マウスのCD4T細胞をエフェクター細胞として、OVAタンパクもしくはOVA32_<323-339>ペプチドでパルスした脾細胞をターゲット細胞とした細胞増殖活性を測定して評価する。

为了详细研究通过EV方法免疫后的CTL反应，编码Siinfekl的质粒是源自OVA蛋白的KB限制表位，被合成为模型抗原，然后创建了质粒，并将其掺入了质粒。质粒是PCDNA3（Invitrogen），可以在哺乳动物细胞中表达。该疫苗是通过以下方式进行的：在全身麻醉下（C57BL/6）将200μg质粒的一半注入两个股四头肌。然后在同一注射部位（BTX ECM830）进行体内电穿孔。将2针阵列选举插入横穿注入部位，并用100V，50msec和6 pulse（重新杆重新启动一次并总共燃烧两个）。比较1到2次的免疫时间。小鼠在免疫的第7、14和21日在3个时间点死亡，并收集了区域淋巴结和脾脏。用Kb/siinfekl四聚体（PE共轭）（由Coulter制造）检测到CD8+ T细胞中的CTL细胞数量。使用抗级II/FITC抗体和抗CD8/PERCP抗体同时进行四聚体染色，并用FACSCalibur进行分析。由于不能仅使用四聚体来研究实际的细胞杀伤效果，因此使用体内细胞毒性测定方法分析每个时间点的功能方面。在相同的测定方法中，从合成小鼠（CD90.1表达，BL6PL小鼠）收集的同种异体脾细胞分为两组，并且在一组经过高浓度（50 mm）CFSE染色后，另一个经过高浓度（5 mm）CFSE染色，仅在peptide脉冲中表现出高度浓度。然后，两组中相同数量的细胞通过尾静脉静脉内给药，并根据48小时后收集的脾脏调节细胞浮动液，并采用存在的两组中的细胞数量以检查细胞杀死效果。在免疫的小鼠中，高浓度组（肽脉冲组）中的细胞被诱导的CTL杀死，从而导致相对低浓度组的细胞数量增加。结果，我们能够确认对模型抗原OVA的免疫反应。体内细胞毒性测定与对照组相比证实了细胞的杀伤作用。下一步是一个接一个地进行以下实验。同样准备了一种编码OVA__ <323-339>的质粒（ISQAVHAAHHAEineAgr），一种MHC II类限制性肽，源自OVA，同样准备以使小鼠免疫和测量辅助T细胞的活性。为了进行测量，使用来自免疫小鼠的CD4T细胞作为效应细胞进行测量和评估细胞增殖活性，并用OVA蛋白或OVA32_ <323-339>肽作为靶细胞脉冲的脾细胞作为靶细胞。