Expression of malaria parasite mitochondrial protein in yeast and design of novel antimalarial compounds

疟疾寄生虫线粒体蛋白在酵母中的表达及新型抗疟化合物的设计

基本信息

批准号：
22K14838
负责人：
伊藤剛
金额：
$ 3万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

マラリア原虫リンゴ酸－キノン酸化還元酵素（PfMQO）は、リンゴ酸からオキサロ酢酸への酸化とキノンからキノールへの還元を触媒する。本酵素は、マラリア原虫ミトコンドリアにおいてTCA回路と電子伝達系の構成因子として機能すると考えられており、抗マラリア剤の有望な標的分子として注目されている。2022年度はPfMQOの機能研究を可能とするマラリア化酵母の構築とミトコンドリアにおけるPfMQOの機能解明を目指した。酵母ミトコンドリアのリンゴ酸脱水素酵素（yMDH1）を欠損させ、かわりにPfMQOを組込むことで、推定されているマラリア原虫ミトコンドリアを模倣したマラリア化酵母（PfMQO発現株）を作製した。生育試験の結果、PfMQOの発現はyMDH1欠損株の生育を相補することがわかった。すなわちPfMQOは、TCA回路でリンゴ酸をオキサロ酢酸に酸化するyMDH1と相同な機能を有するミトコンドリアタンパク質であることが示唆された。さらに、PfMQO発現株の細胞分画を実施し、PfMQOがミトコンドリアで機能発現することを明らかにした。また、ミトコンドリアの呼吸活性を測定した結果、PfMQOを介するTCA回路依存的な呼吸活性が認められた。次に、リンゴ酸の取込み能が異なるインタクトおよび超音波処理したミトコンドリアについてPfMQO活性を詳細に比較することで、PfMQOのリンゴ酸反応部位がマトリックス側に位置することを同定した。以上の結果より、PfMQOがTCA回路の構成因子として機能するミトコンドリアタンパク質であることを示した。

疟原虫苹果酸醌氧化还原酶 (PfMQO) 催化苹果酸氧化为草酰乙酸以及醌还原为对苯二酚。这种酶被认为是疟原虫线粒体中 TCA 循环和电子传递链的一个组成部分，并且作为抗疟药物的有前景的靶分子而受到关注。 2022 年，我们的目标是构建疟疾酵母，以实现 PfMQO 的功能研究并阐明 PfMQO 在线粒体中的功能。通过删除酵母线粒体苹果酸脱氢酶 (yMDH1) 并掺入 PfMQO，我们创建了模仿假定的疟疾寄生虫线粒体的疟疾酵母（表达 PfMQO 的菌株）。生长测试的结果发现，PfMQO的表达补充了yMDH1缺陷菌株的生长。这表明PfMQO是一种线粒体蛋白，其功能与yMDH1同源，yMDH1在TCA循环中将苹果酸氧化为草酰乙酸。此外，我们对表达 PfMQO 的菌株进行了细胞分级分离，发现 PfMQO 在线粒体中功能性表达。此外，作为测量线粒体呼吸活动的结果，观察到由PfMQO介导的TCA循环依赖性呼吸活动。接下来，通过比较完整线粒体和超声处理线粒体中的 PfMQO 活性（它们吸收苹果酸的能力不同），我们确定 PfMQO 的苹果酸反应位点位于基质侧。上述结果表明，PfMQO 是一种线粒体蛋白，作为 TCA 循环的组成部分发挥作用。