四肢の運動ニューロン特異的神経回路形成機構

四肢运动神经元特异性神经回路形成机制

基本信息

批准号：
10156232
负责人：
田中英明
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10156232/
关键词：
運動ニューロンニワトリ胚 Eph 受容体型チロシンキナーゼ ephrin

项目摘要

我々はこれまでに、Eph受容体型チロシンキナーゼEphA3、EphA4がニワトリ胚運動ニューロンのサブタイプ特異的に、また発生過程に一過性に発現し、Ephファミリーのリガンドephrin-A2、ephrin-A5によりその軸索成長が阻害されることを見出し、これらのEph関連分子の生体内での機能を解析するため、機能阻害抗体を開発した。これらの機能阻害活性を持つ抗EphA4抗体と抗ephrin-A2抗体のエピトープを決定するために、それぞれのcDNAを用い、PCRにより部分cDNAをクローニングし、293細胞に発現させ細胞の免疫染色と培養上清のイムノブロットで解析した。その結果、抗EphA4抗体はシステインリッチ部分のほぼ中央、抗ephrin-A2抗体B3はN末端近くの約40アミノ酸にエピトープが存在することが明らかになり、さらに領域を小さくして解析中である。さらに、阻害抗体の作用を解析する基礎として腰部運動ニューロンと後肢筋における受容体EphA3とEphA4、リガンドephrin-A2とephrin-A5の発現分布を免疫染色により詳細に解析した。運動ニューロンには全体にEphA4が先に発現され、EphA3は極一部の運動ニューロンに発現される。運動ニューロンにはまたリガンドephrin-A2とephrin-A5のmRNAの発現が観察されていたが、蛋白レベルでも弱いながら発現が観察された。一部の筋の筋周膜と神経線維には受容体EphA3とEphA4、リガンドephrin-A2とephrin-A5共に発現されていた。

我们之前已经证明，Eph 受体酪氨酸激酶 EphA3 和 EphA4 在鸡胚胎运动神经元的发育过程中亚型特异性且短暂地表达，并且它们由 Eph 家族配体肝配蛋白-A2 和肝配蛋白-A5 表达。抑制，并开发了功能阻断抗体来分析这些 Eph 相关分子的体内功能。为了确定具有这些功能性抑制活性的抗EphA4和抗ephrin-A2抗体的表位，我们利用各自的cDNA通过PCR克隆了部分cDNA，在293细胞中表达它们，并进行细胞免疫染色和培养上清。通过免疫印迹进行分析。结果表明，抗EphA4抗体在富含半胱氨酸的区域的大约中心处具有表位，并且抗肝配蛋白-A2抗体B3在靠近N末端的约40个氨基酸处具有表位，正在进一步分析以缩小该区域。此外，作为分析抑制性抗体作用的基础，我们通过免疫染色详细分析了腰部运动神经元和后肢肌肉中受体EphA3和EphA4以及配体ephrin-A2和ephrin-A5的表达分布。 EphA4首先在所有运动神经元中表达，EphA3在少数运动神经元中表达。在运动神经元中也观察到配体肝配蛋白-A2和肝配蛋白-A5的mRNA表达，并且在蛋白质水平也观察到弱表达。受体EphA3和EphA4以及配体肝配蛋白-A2和肝配蛋白-A5均在一些肌肉的肌束膜和神经纤维中表达。