タンパク質合成用高効率リガーゼシステムの開発

开发用于蛋白质合成的高效连接酶系统

基本信息

批准号：
08650938
负责人：
三原久和
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

糖鎖やリン酸基を有するペプチド・タンパク質は、物質間および細胞間認識、あるいはそれらを利用した医薬品の開発基礎研究のために重要な材料となる。しかし、実際にタンパク質と呼ばれるアミノ酸100残基以上の長鎖ペプチドや側鎖に糖やリン酸基を有する複雑な構造の長鎖ペプチドの合成は未だ不可能である。そこで、側鎖に糖鎖等を有するタンパク質部分フラグメントと化学合成したポリペプチドとを水溶液中で縮合可能な試薬つまりペプチドリガーゼを開発すれば、上記の複雑な構造を有するタンパク質を合成することが可能になる。本研究では、迅速に化学合成可能なペプチドどうしを水溶液中において縮合し、タンパク質合成に応用可能なペプチドリガーゼシステムを開発することを目的とし、研究を行った。人工リガーゼとして、化学的変換酵素チオールサブチリシンを用いた新規のシステムの構築に成功した。1)チオールサブチリシンの簡便・量的調製方の確立:酵素のアフィニティーカラム法を利用した簡便・量的調製法の確立を行った。2)短鎖ペプチドチオエステルを基質としたリガーゼ反応:ペプチドチオエステルをチオールサブチリシン触媒反応の新規基質として採用し、まず短鎖のペプチドチオエステルを用いて、2時間程度の触媒反応で80%以上の収率でペプチドリガーゼ反応を行うシステムを確立した。アミノ酸配列選択性や反応条件(pH、温度、溶媒など)の最適化を行った。3)長鎖ペプチドチオエステルを基質としたリガーゼ反応:2)の基礎実験成果をふまえて、実際に有用なペプチド・タンパク質の合成を、チオエステル合成法およびチオールサブチリシン触媒反応を連携させることにより実行し、成功した。がん遺伝子産物タンパク質c-Mybのフラグメントペプチド(20残基)や細胞のプログラム死アポトーシスに関連したリ-パ-タンパク質(65残基)のリガーゼ触媒合成に成功し、本チオエステル基質を用いるペプチド・タンパク質リガーゼシステムの開発に成功した。

具有糖链和磷酸基团的肽和蛋白质是物质与细胞之间识别的基础研究以及利用它们开发药物的重要材料。然而，目前仍然不可能合成具有超过100个氨基酸残基的称为蛋白质的长链肽，或者侧链具有糖或磷酸基团的结构复杂的长链肽。因此，通过开发一种能够在水溶液中将化学合成的多肽与侧链具有糖链的蛋白质部分片段缩合的试剂，即肽连接酶，可以合成具有上述复杂结构的蛋白质。。变得。在本研究中，我们进行研究的目的是开发一种肽连接酶系统，该系统可通过缩合可在水溶液中快速化学合成的肽来应用于蛋白质合成。我们成功地构建了一个使用化学转化酶硫醇枯草杆菌蛋白酶作为人工连接酶的新系统。 1）硫醇枯草杆菌蛋白酶的简单定量制备方法的建立：我们利用酶亲和柱法建立了一种简单定量的制备方法。 2）使用短链肽硫酯作为底物的连接酶反应：采用肽硫酯作为硫醇枯草杆菌蛋白酶催化反应的新底物我们建立了高产率进行肽连接酶反应的系统。优化了氨基酸序列选择性和反应条件（pH、温度、溶剂等）。 3）以长链肽硫酯为底物的连接酶反应：在2）的基础实验结果的基础上，通过硫酯合成法与硫醇枯草杆菌蛋白酶催化反应连接，进行了实际有用的肽和蛋白质的合成。成功的。我们成功地通过连接酶催化合成了癌基因产物蛋白c-Myb的片段肽（20个残基）和与程序性细胞死亡和凋亡相关的收割者蛋白（65个残基），并证明使用这种硫酯底物的肽肽成功开发了蛋白质连接酶系统。