創薬研究のための昆虫抽出液バイオリアクターを用いた新規ペプチド合成システムの開発

使用昆虫提取物生物反应器开发新型肽合成系统用于药物发现研究

基本信息

批准号：
22K04849
负责人：
伊東昌章
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Okinawa National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

感染症等の治療薬開発に向けてペプチド創薬研究が活発化している。しかし、研究に用いる高分子量のペプチド合成において、固相合成等化学的方法では迅速化やスケールアップが難しく、組換え大腸菌ではジスルフィド結合が形成できない等の不具合があり、研究推進の障壁となっている。そのため、本研究では、我々が発案・実用化した昆虫無細胞タンパク質合成系を基盤とし、昆虫抽出液をバイオリアクターとして用いた新規ペプチド合成システムを開発し、「ペプチド創薬研究に活用できる技術」に創りあげることを目的とする。初年度となる２０２２年度では、低分子タンパク質に相当するいずれも抗菌性を有する170アミノ酸残基のHuman cathelicidin(LL-37, 19 kDa)、 94アミノ酸残基のHuman defensin 5(α-Defensin-5, 10kDa) を用いて合成系および評価系の構築を行った。C末端にStrep-tagⅡ配列を導入したLL-37、およびα-Defensin-5発現プラスミドを鋳型として、mRNA合成キットを用いてmRNAを合成した。合成したmRNAにカイコ後部絹糸腺抽出液、リアクションバッファを加えて、２５℃、５時間、合成を行った。その後、反応液を用いてウエスタンブロット解析を行った。その結果、LL-37およびα-Defensin-5は、どちらも想定される分子量の２１kＤaおよび１２kDa付近(遺伝子+スペーサー+Strep tag IIのため)に特異的なバンドとして検出することができた。これにより、本年度の目標を達成することができた。２０２３度以降は、構築した評価系と分子量の異なる低分子タンパク質およびペプチド５種程度を用い、合成条件等を最適化することで、100 μg/ml 以上の効率で機能性を有するペプチドの合成を実現する。

肽药物发现研究正在为感染性疾病等治疗药物的开发提供动力。然而，在合成用于研究的高分子量肽时，利用固相合成等化学方法很难加速或放大，并且存在无法与重组大肠杆菌形成二硫键等问题，这对研究的推进造成了障碍。因此，在本研究中，我们将在我们发明并投入实用的昆虫无细胞蛋白质合成系统的基础上，开发一种以昆虫提取物作为生物反应器的新型肽合成系统，并将开发出可用于肽的技术药物发现研究的目的。第一年2022财年，我们将引入具有170个氨基酸残基且具有抗菌特性的人导管素（LL-37，19 kDa）和具有94个氨基酸残基的人防御素5（α-Defensin-5），相当于低分子量蛋白质，10kDa）构建合成和评价体系。使用C末端引入Strep-tag II序列的LL-37和α-Defensin-5表达质粒作为模板，使用mRNA合成试剂盒合成mRNA。将蚕后丝腺提取物和反应缓冲液添加到合成的mRNA中，并在25℃下进行合成5小时。然后，使用反应溶液进行蛋白质印迹分析。结果，LL-37 和 α-Defensin-5 均可以检测为特异性条带，预期分子量约为 21 kDa 和 12 kDa（由于基因+间隔区+Strep 标签 II）。结果，我们能够实现今年的目标。 2023年之后，我们将利用构建的评价体系和约5种不同分子量的低分子蛋白和多肽，优化合成条件等，合成效率达到100μg/ml或意识到更多。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Inhibition of α‐amylase and α‐glucosidase by Morus australis fruit extract and its components iminosugar, anthocyanin, and glucose

桑果提取物及其成分亚氨基糖、花青素、葡萄糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

DOI：
10.1111/1750-3841.16098
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
3.9
作者：
Qiao Ying;Ikeda Yuki;Ito Masaaki;Kimura Toshiyuki;Ikeuchi Takeaki;Takita Teisuke;Yasukawa Kiyoshi
通讯作者：
Yasukawa Kiyoshi

Inhibition of α-glucosidase by Morus australis fruit food

桑果食品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
So Nishimoto; Yuki Ikeda; Ying Qiao; Hideaki Minami; Masaaki Ito; Toshiyuki Kimura; Teisuke Takita; Kiyoshi Yasukawa
通讯作者：
Kiyoshi Yasukawa

バイオプロセスを用いた有用性物質生産技術　第7章第7節カイコ無細胞系を用いたタンパク質生産と分離技術 504-510

利用生物过程的有用物质生产技术第7章第7节利用蚕无细胞系统的蛋白质生产和分离技术504-510