Study on structures, functions and applications of novel endo-type and exo-type glycoceramidases involved in glycosphingolipid metabolism

鞘糖脂代谢中新型内切型和外切型神经酰胺酶的结构、功能及应用研究

基本信息

批准号：
19380061
负责人：
ITO Makoto
金额：
$ 12.9万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

スフィンゴ脂質は、形質膜ミクロドメインに主として存在し、細胞内のシグナリングや細胞間の相互作用に重要な役割を演じている。本研究では、申請者らが発見した非リソソーム性スフィンゴ脂質代謝酵素の構造と機能について研究を行い、以下のような成果を上げた。先ず、哺乳動物の細胞質に存在するグルコシルセラミド(GlcCer)分解酵素(エキソ型グリコセラミダーゼ)をクローニングした。本酵素は、老化関連タンパク質クロトーのホモログ(KLrP)であった。本酵素の活性をRNAi で抑制すると、細胞内のGlcCer 量およびGlcCer骨格を持つ糖脂質量が減少することを見出し、KLrPが細胞の糖脂質代謝に関わっていることを示した。本酵素を大腸菌で大量に発現させ、グルコース及びガラクトースとの共結晶を作製し、X線結晶構造解析を行った。その結果、KLrPはαヘリックスとβストランドを8回繰り返す、典型的なTIMバレル構造を示すこと、β-ストランド4および7のC 末に存在するE165とE373がそれぞれ酸/塩基触媒残基、求核残基であることを証明した。また、本研究においてリソソーム性の中性セラミダーゼの結晶構造解析に初めて成功した。その構造は今までに報告のない新しいものであり、その触媒機構は亜鉛を触媒中心とすることを明らかにした。構造を解くことで、スフィンゴ脂質シグナリングや食餌由来のセラミドの代謝・消化への関与等、本酵素の多彩な機能が合理的に説明できた。一方、放線菌から単離したエンド型グリコセラミダーゼ(EGALC)の基質特異性を詳細に調べ、本酵素は6ガラ系列糖脂質に特異的に作用することを明らかにした。また、EGALC は加水分解のみならず糖鎖の転移反応も効率よく触媒することも明らかになった。この特異性を利用した、6-ガラ系列糖脂質の蛍光標識法及び微量定量法を開発し、その方法を用いて、病原性の原虫、糸状菌、及び食用海藻等に6-ガラ系列糖脂質が存在することを見出した。海藻から単離した6-ガラ系列糖脂質の構造解析を行い、その構造を1-phytyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1-6)-β-D-galactopyranosyl]- glycerol と同定した。このような構造の糖脂質は初めての報告である。

鞘脂主要存在于质膜微域中，并在细胞内信号传导和细胞细胞相互作用中起重要作用。在这项研究中，我们研究了申请人发现的非溶酶体鞘脂代谢酶的结构和功能，并实现了以下结果。首先，将存在于哺乳动物细胞质中的葡萄糖基酶（GLCCER）降解酶（外型糖果酰胺酶）。该酶是与衰老相关蛋白质衣服的同源物（KLRP）。我们发现，用RNAi抑制该酶的活性可减少用GLCCER主链在细胞中GLCCER和糖脂的量，这表明KLRP参与细胞糖脂代谢。该酶在大肠杆菌中大量表达，制备了葡萄糖和半乳糖的共晶体，并进行了X射线晶体结构分析。结果，KLRP表现出典型的TIM桶结构，重复α-螺旋和β链八次，并证明在β链4和7的C末端存在E165和E373分别是酸/碱基催化的残基和亲核残基。此外，这项研究在溶酶体中性法胺酶的晶体结构分析中首次成功。它的结构是到目前为止尚未报道的一种新型结构，其催化机制被发现为锌作为催化剂。通过阐明结构，我们能够合理地解释该酶的各种功能，例如鞘脂信号传导以及参与饮食衍生的神经酰胺代谢和消化。另一方面，详细研究了从放线菌中分离的内糖果酰胺酶（EGALC）的底物特异性，表明该酶特异性地作用于六甘糖糖胆脂脂。也已经表明，每个人类不仅有效地催化水解，还可以有效地催化糖链转移反应。使用这种特异性，开发了一种荧光标记方法和6-GALA系列糖脂的痕量定量方法，并使用这种方法发现，在致病的原生动物，丝状真菌和可食用的海藻中存在6加仑系列的糖脂。从海藻中分离出的6-GALA系列糖脂的结构分析，并将结构鉴定为1-phytyl-3-o- [α-D-甲基乳py-乙酰吡喃糖基 - （1-6）-β-D-甲基乳乙酰丙烷基] - 甘油。这是第一次报道了具有此类结构的糖脂。