Study on structures, functions and applications of novel endo-type and exo-type glycoceramidases involved in glycosphingolipid metabolism

鞘糖脂代谢中新型内切型和外切型神经酰胺酶的结构、功能及应用研究

基本信息

批准号：
19380061
负责人：
ITO Makoto
金额：
$ 12.9万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

スフィンゴ脂質は、形質膜ミクロドメインに主として存在し、細胞内のシグナリングや細胞間の相互作用に重要な役割を演じている。本研究では、申請者らが発見した非リソソーム性スフィンゴ脂質代謝酵素の構造と機能について研究を行い、以下のような成果を上げた。先ず、哺乳動物の細胞質に存在するグルコシルセラミド(GlcCer)分解酵素(エキソ型グリコセラミダーゼ)をクローニングした。本酵素は、老化関連タンパク質クロトーのホモログ(KLrP)であった。本酵素の活性をRNAi で抑制すると、細胞内のGlcCer 量およびGlcCer骨格を持つ糖脂質量が減少することを見出し、KLrPが細胞の糖脂質代謝に関わっていることを示した。本酵素を大腸菌で大量に発現させ、グルコース及びガラクトースとの共結晶を作製し、X線結晶構造解析を行った。その結果、KLrPはαヘリックスとβストランドを8回繰り返す、典型的なTIMバレル構造を示すこと、β-ストランド4および7のC 末に存在するE165とE373がそれぞれ酸/塩基触媒残基、求核残基であることを証明した。また、本研究においてリソソーム性の中性セラミダーゼの結晶構造解析に初めて成功した。その構造は今までに報告のない新しいものであり、その触媒機構は亜鉛を触媒中心とすることを明らかにした。構造を解くことで、スフィンゴ脂質シグナリングや食餌由来のセラミドの代謝・消化への関与等、本酵素の多彩な機能が合理的に説明できた。一方、放線菌から単離したエンド型グリコセラミダーゼ(EGALC)の基質特異性を詳細に調べ、本酵素は6ガラ系列糖脂質に特異的に作用することを明らかにした。また、EGALC は加水分解のみならず糖鎖の転移反応も効率よく触媒することも明らかになった。この特異性を利用した、6-ガラ系列糖脂質の蛍光標識法及び微量定量法を開発し、その方法を用いて、病原性の原虫、糸状菌、及び食用海藻等に6-ガラ系列糖脂質が存在することを見出した。海藻から単離した6-ガラ系列糖脂質の構造解析を行い、その構造を1-phytyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1-6)-β-D-galactopyranosyl]- glycerol と同定した。このような構造の糖脂質は初めての報告である。

辛哥脂质主要在经跨微型构中发现，这在细胞间信号传导和细胞间相互作用中起着重要作用。在这项研究中，进行了以下结果，对申请人发现的非舒张性Spingo代谢酶的结构和功能进行了，并获得了以下结果。首先，将存在于哺乳动物动物的细胞质中的葡萄糖基酶（GLCCER）降解酶（Exiso -type Glycocera Midase）。该酶是与衰老相关蛋白质Croteau的同源物（KLRP）。 RNAi用RNAi抑制了该酶的活性，发现细胞中的GLCCER量和带有GLCCER骨骼的Glycos脂肪降低，表明KLRP参与细胞的糖糖索糖的代谢。该酶在大肠杆菌中大量表达，制成了葡萄糖和半乳糖的二晶，进行了X射线晶体结构分析。结果，KLRP显示了典型的TIM桶结构，该结构可重复α螺旋和β链八次，而在β-链4和7结束时存在的E165和E373是酸/基本催化剂残留物，以及要求。在这项研究中，溶酶体中性天盘酶的晶体结构分析首次成功。该结构是一种从未有报道的新结构，催化剂机制表明锌以催化剂为中心。通过求解结构，可以合理解释该酶的各种功能，例如Spingo脂肪信号传导以及神经酰胺衍生的神经酰胺代谢和消化的参与。另一方面，对从接线细菌中分离出的末端 - 类糖中糖（Egalc）的底物特异性进行了详细检查，并揭示了该酶在6种伴随糖的糖脂质上专门起作用。还揭示了每个人不仅水解了糖链转移反应的催化剂。开发了使用这种特殊性的6-加加拉相关的葡萄糖脂质脂质脂质和微核定量方法，并使用该方法，6-甘兰菌相关的糖脂质用于致病性原生动物，细菌，可食用的海藻等。我发现它存在于其。从海藻分离出的6-甘糖膜相关糖脂质的结构分析是1-phytyl-3-o- [α-D-半乳吡喃糖基 - （1-6）-a-d-d-d-d----------eractopyranosyl] - 甘油和甘油。这种结构的糖脂质是第一个报告。