Sortaseを標的とした新しい病原細菌感染症予防法の開発に関する基礎研究

针对Sortase的病原菌感染预防新方法开发的基础研究

基本信息

批准号：
18890190
负责人：
深町はるか
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18890190/
关键词：
Sortase Dextranase 齲蝕予防

项目摘要

申請者らの研究室では抗生物質やワクチンとは作用機序の異なる新たな病原細菌感染症の治療と予防法の開発につながる基礎研究を進めている。その中で齲蝕細菌(グラム陽性球菌)がもつSortase(細胞膜に存在するシステインプロテアーゼの一種)が齲蝕細菌の表層病原タンパク因子の細胞局在性を触媒していることを明らかにし、Sorbseが齲蝕細菌感染症の治療と予防に有用な標的酵素であることを示唆してきた。本研究では、まず、表層タンパク質の膜局在性を支配するSortase阻害剤開発のためにSortase活性の簡易・高感度測定法を開発する。mutans連鎖球菌群のもつデキストラン分解酵素はSortaseの基質となり、ブルーデキストランを含むSDS-PAGEで活性を容易に測定できることから、このデキストラン分解酵素活性測定法を改良してデキストラン分解酵素を基質としたSortase活性測定法を開発することとした。そのために、まずmutans連鎖球菌群のひとつであるS.cricetusのデキストラン分解酵素遺伝子について解析し、3603bp推定分子量128kDaのタンパク質であることを明らかにした。また、この遺伝子について解析したところ、C末端にSortase認識部位LPKTGモチーフと疎水性領域および荷電末端をもち、Sortaseの基質となりうることが分かった。発現ベクターpGEX6P-1にサブクローニングし、GST融合タンパク質を精製してブルーデキストランSDS-PAGEを行ったところ、ブルーデキストラン分解活性が確認されたので、この酵素を用いて、Sortaseの活性測定法を開発する。

申请人的实验室正在进行基础研究，这将导致新的致病细菌感染的治疗和预防方法的发展，这些病原菌感染具有与抗生素和疫苗不同的作用机制。已经揭示了龋齿（革兰氏阳性球菌）（革兰氏阳性球菌中存在的一种半胱氨酸蛋白酶）催化龋齿表面病原体蛋白质因子的细胞定位，这表明sorbse是用于治疗龋齿细菌感染的有用靶酶。在这项研究中，我们将首先开发一种简单且高度敏感的方法，用于测量分类酶活性，以开发控制表面蛋白质膜定位的排序酶抑制剂。突变型链球菌基团的右旋降解酶是分类酶的底物，并且可以使用含有蓝色葡萄糖的SDS-PAGE轻松测量活性，因此我们决定改善这种测量葡萄糖降解酶的活性的方法，并使用脱氧化酶来测量脱氧化酶的方法，以脱氧化酶来进行脱氧化酶，以辅助促进。为此，我们首先分析了Cricetus链球菌中的链球菌链球菌链球菌中的葡聚糖降解酶基因，并发现它是一种蛋白质，估计分子量为3603 bp 128 kDa。此外，对该基因的分析表明，它在C末端，疏水区域和带电的末端具有分子酶识别位点LPKTG基序，并且可以用作分子酶的底物。将酶亚克隆到表达载体PGEX6P-1中，并将GST融合蛋白纯化，并使用蓝色右旋体SDS-PAGE来确认蓝色葡萄糖的降解活性，并使用该酶开发了一种测量排序酶活性的方法。