Helicobacter pylori熱ショック蛋白の精製,製造解析と発現機構

幽门螺杆菌热休克蛋白的纯化、生产分析及表达机制

• 批准号: 07770205
• 负责人: 山口 博之
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770205/
• 关键词: Helicobacter pylori; 熱ショック蛋白; HSP60; モノクローナル抗体; 病原因子

1.H. Pylori HSP60の精製と構造解析(1)H. Pylori HSP60を確認するマウスモノクローナル抗体(mAb)の確立:H. Pylori HSP60の精製を目的として本菌HSP60 を認識するmAbの作製を試みた。BALB/cマウスへの投与抗原にはSDS-PAGEのゲルより回収したH. Pylori 60kDa蛋白抗原を用いた。またこの抗原を固相化したELISAによりスクリーニングを行った。その結果、2つのmAb(H9およびH20)を確立した。H9およびH20mAbのクラスおよびサブクラスはそれぞれlgG2aおよびlgMであった。どちらのmAbも熱ショック応答により大量に誘導された本菌60kDa抗原を認識したことより,H. Pylori HSP60を認識していると考えられた。(2)H. Pylori HSP60を抗原構造:ELISAおよびイムノブロット法においてH9およびH20mAbはH. Pyloriと反応したが,FACSにおいてはH20mAbのみが反応した。これらの結果より,どちらのmAbも未変性および変性したどちらの状態のHSP60も認識した。またH20mAbの認識するエピトープは本菌菌体表層に存在しているが,H9mAbの認識するエピトープは菌体内に存在していると考えられた。2.H. Pylori HSP60とヒト胃粘膜組織中HSP60とエピトープの相同性についての検討(1)H. Pylori HSP60を認識する3C8mAbの認識するエピトープのアミノ酸配列:既に確立していたYersinia enterocolitica HSP60を認識するmAb,3C8がH. Pylori HSP60とヒト胃癌由来細胞株と反応することを明らかにした(J.Gastroenterol. 1996 inpress)。また本3C8mAbの認識するエピトープのアミノ酸配列にLue Gly Valの3つのアミノ酸が関与することを明らかにした(Microbiol. lmmunol. 40(1) 77-80 1996)。(2)H. Pylori HSP60を認識するH9およびH20mAbの反応性:どちらのmAbもH. Pylori HSP60およびヒト胃癌由来細胞株MKN45と反応性を示した。しかしながらH9mAbはEsherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosaと反応したがH20mAbは反応しなかった。これらの結果より,H. Pylori HSP60とヒト胃細胞に特異的なエピトープの存在する可能性が示唆された。3.H. Pylori HSP60と病原因子との関連性H. Pylori HSP60の発現と病原因子との相関性:本菌のHSP60の発現,ウレアーゼ活性,空胞化毒素産生性およびヒト胃癌由来細胞株への付着率との間の相関性について検討した結果,本菌HSP60の発現と付着率との間に相関性が認められることを明らかにした(J.Med.Microbiol. 1996 inpress)。

1. H. Pylori HSP60 的纯化和结构分析 (1) 确认 H. Pylori HSP60 的小鼠单克隆抗体 (mAb) 的建立：尝试创建识别该细菌 HSP60 的 mAb，以纯化 H. Pylori HSP60塔。使用从SDS-PAGE凝胶回收的幽门螺杆菌60kDa蛋白抗原作为给予BALB/c小鼠的抗原。还使用固定化的该抗原通过ELISA进行筛选。结果，建立了两种mAb（H9和H20）。 H9和H20 mAb的类别和亚类分别是lgG2a和lgM。这两种 mAb 都被认为能够识别幽门螺杆菌 HSP60，因为它们识别这种细菌的 60kDa 抗原，该抗原是由热休克反应大量诱导的。 (2)幽门螺杆菌HSP60的抗原结构：在ELISA和免疫印迹中，H9和H20 mAb与幽门螺杆菌反应，但只有H20 mAb与FACS反应。这些结果表明，两种 mAb 都能识别天然状态和变性状态下的 HSP60。此外，H20mAb识别的表位存在于细菌细胞的表面层，而H9mAb识别的表位被认为存在于细菌细胞内。 2. H. Pylori HSP60 与人胃粘膜组织中 HSP60 的表位同源性检查 (1) 识别 H. Pylori HSP60 的 3C8 mAb 识别的表位的氨基酸序列： 识别已经建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌 HSP60 mAb，3C8 , 是幽门螺杆菌据透露，它与 HSP60 和人胃癌衍生细胞系发生反应（J. Gastroenterol. 1996 inpress）。我们还揭示了 Lue Gly Val 的三个氨基酸参与了该 3C8 mAb 识别的表位的氨基酸序列（Microbiol. Immunol. 40(1) 77-80 1996）。 (2)识别幽门螺杆菌HSP60的H9和H20 mAb的反应性：两种mAb均显示出与幽门螺杆菌HSP60和人胃癌来源的细胞系MKN45的反应性。然而，H9mAb 与大肠杆菌、宋内志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌发生反应，但 H20mAb 则不发生反应。这些结果表明可能存在幽门螺杆菌HSP60和人胃细胞特异的表位。 3. H. Pylori HSP60 与毒力因子的关系 H. Pylori HSP60 表达与毒力因子的相关性： H. Pylori HSP60 的表达、脲酶活性、该菌空泡毒素的产生及其对人胃癌细胞株的影响在考察粘附率之间的相关性时，我们发现该细菌的HSP60的表达与粘附率之间存在相关性（J.Med.Microbiol. 1996年印象）。

项目成果

Hiroyuki Yamaguchi et al.: "Flowcytometric analysis of the heat shock protein 60 expressed on the cell surface of Helicobacter pylori" J. Med. Microbiol.(inpress). (1996)

Hiroyuki Yamaguchi 等人：“幽门螺杆菌细胞表面表达的热休克蛋白 60 的流式细胞术分析”J. Med。