シナプスにおけるNMDA受容体の動的集合機構の解明:1分子観察法による研究

阐明突触处 NMDA 受体的动态组装机制：使用单分子观察方法的研究

• 批准号: 07J03337
• 负责人: 田中 賢治
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J03337/
• 关键词: ラフトマイクロドメイン; NMDA受容体; シナプス; 1分子追跡法; ラフト; アクチン膜骨格; GPIアンカー型タンパク質; ホップ拡散; 高速1粒子追跡; 蛍光1分子追跡; 細胞膜

本研究の基盤的知見を得るため、細胞膜上でのリン脂質分子DOPE、DMPE、DPPEやラフト親和性分子Bodipy-Cholesterolを、1分子追跡法を用いて観察した。その結果、時間分解能33ミリ秒でも、20マイクロ秒でも、脂質依存的な数百ナノメートルの大きなラフトは観察することはできなかった。また、すべてのリン脂質はラフト依存的ではなく、アクチン依存的にホップ拡散運動していることを明確に示すことができた。また、ラフト観察に頻繁に用いられている従来の化学固定法では、シナプスに存在するラフト分子は固定することができないことを示すことができた。すなわち、細胞膜の細胞質側にあるLynやCbpなどのタンパク質は、典型的な固定条件である『4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で30分』では1分子の運動は95%以上止まるが、ラフトやシグナル伝達に関わるGPIアンカー型タンパク質は40%以上がまだ運動していた。さらに3.6%PFA+グルタールアルデヒド(GA)0.1%溶液で30分処報しても、約30%の分子がまだ動いていた。そして、これらのラフト分子を90%以上固定するには、3.6%PFA+GA0.2%溶液で90分処理しなければならないことを世界で初めて示すことができた。さらに、抗体によって膜分子のクラスター化を誘導してしまう可能性についても検討した。すなわち、ラフト親和性分子であるGPIアンカー型タンパク質や、H-Rasを、4%PFAで30分間固定後に1次抗体-2次抗体でそれぞれラベルすると、抗体でラベル前に比べて、それぞれ3.7倍～6.6倍、2.3倍～3.3倍もクロスリンクされることが初めてわかった。これらの結果は、これまで頻繁に用いられてきた通常の架橋条件では、固定が不完全でアーチファクトを誘起している可能性が非常に高く、この40年くらいの研究結果の多くに見直しが必要なことを示すことができた。

为了获得本研究的基础知识，我们采用单分子追踪方法观察了细胞膜上的磷脂分子DOPE、DMPE和DPPE，以及筏亲和分子Bodipy-Cholesterol。结果，即使时间分辨率为 33 毫秒或 20 微秒，也无法观察到数百纳米的大型脂质依赖性筏。此外，我们能够清楚地证明所有磷脂都以肌动蛋白依赖性方式移动，而不是以筏依赖性方式移动。此外，我们能够证明突触中存在的筏分子不能使用经常用于观察筏的传统化学固定方法来固定。换句话说，对于位于细胞膜胞质侧的Lyn和Cbp等蛋白质，在“4%多聚甲醛（PFA）溶液中30分钟”的典型固定条件下，一个分子95%以上的运动被停止。 ”，但超过 40% 参与信号转导的 GPI 锚定蛋白仍然活跃。此外，即使用 3.6% PFA + 0.1% 戊二醛 (GA) 溶液处理 30 分钟后，大约 30% 的分子仍然处于运动状态。我们还能够在世界上首次证明，为了固定 90% 以上的筏分子，需要用 3.6% PFA + GA 0.2% 溶液处理 90 分钟。此外，我们研究了抗体诱导膜分子聚集的可能性。换句话说，当GPI锚定蛋白和H-Ras（筏亲和分子）在用4% PFA固定30分钟后用一抗和二抗标记时，效果比用抗体标记前高3.7倍。首次发现交联度~6.6倍，以及2.3倍~3.3倍。这些结果很可能是由于经常使用的正常交联条件引起的不完全固定和伪影，并且需要回顾过去 40 年左右的许多研究结果来证明这一点。 。