mRNA遺伝情報の正確性に関する化学生物学的研究

mRNA遗传信息准确性的化学生物学研究

基本信息

批准号：
18780091
负责人：
甲斐田大輔
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780091/
关键词：
スプライシング mRNA 低分子化合物

项目摘要

前年度において同定したFR901464の細胞内標的であるSF3b複合体とFR901464との結合様式を詳細に検討した。なお,以後の実験ではFR901464のメチルアセタール体であり、化学的により安定な化合物スプライソスタチンAを用いた。まず、スプライソスタチンAとSF3b複合体の結合が、共有結合と非共有結合のいずれであるかを確かめたところ、この結合は非共有結合であることがわかった。次に、SF3b複合体は7つのタンパク質からなっていることが知られているが、スプライソスタチンAはどのタンパク質と直接結合しているかを検討したところ、断定はできないものの、構成タンパク質のSAP155,もしくはSAP130のいずれかに結合していることが示唆されるデータを得た。次にスプライソスタチンA処理によって蓄積した未成熟mRNAが核外に輸送されるのかどうかを確かめるために、FISH法を用いpoly(A)-RNAの局在を観察したところ、その大部分が核内に蓄積しスプライシング因子であるSC35と共局在を示した。しかし、核内と細胞質のmRNAを分画しRT-PCR法を用いて実験を行ったところ、未成熟mRNAの一部は核外に局在していることがわかり、その一部の細胞質に輸送された未成熟mRNAが翻訳され異常なタンパク質が生成されていることが示唆された。しかし、何種類かの遺伝子においてスプライソスタチンA処理による未成熟mRNAの蓄積と、異常タンパク質の生成に関して実験を行ったところ、調べた限り全ての遺伝子で未成熟mRNAの蓄積が観察されたものの、異常なタンパク質の生成はいくつかの遺伝子に限られていた。以上のことから、スプライソスタチンAは未成熟mRNAの核外輸送にも関わっていることが示唆された。

我们详细研究了 FR901464 与 SF3b 复合物之间的结合模式，SF3b 复合物是前一年确定的 FR901464 的细胞内靶标。在随后的实验中，使用了spliceostatin A，它是FR901464的甲缩醛，化学性质更稳定。首先，我们确认了spliceostatin A与SF3b复合物之间的结合是共价键还是非共价键，发现该键为非共价键。接下来，已知 SF3b 复合物由七种蛋白质组成，我们研究了剪接抑素 A 直接结合的蛋白质，虽然我们不能确定，但我们发现了组成蛋白质 SAP155，我们获得的数据表明它与任一蛋白质结合SAP130 或 SAP130。接下来，为了确认spliceostatin A处理积累的未成熟mRNA是否被转运出细胞核，我们利用FISH方法观察了poly(A)-RNA的定位，发现大部分都在细胞核中。显示与剪接因子 SC35 共定位。然而，当使用RT-PCR分离细胞核和细胞质mRNA的实验时，发现一些不成熟的mRNA位于细胞核外；这表明转运的不成熟的mRNA被翻译并产生了异常的蛋白质。然而，当我们对由于剪接抑素A处理而导致的几种基因中未成熟mRNA的积累和异常蛋白的产生进行实验时，我们发现在所有研究的基因中都观察到未成熟mRNA的积累，并且异常蛋白的产生是有限的。到一些基因。这些结果表明剪接抑素 A 也参与未成熟 mRNA 的核输出。