液胞膜シンタクシン、Vam3pの局在化機構

液泡膜突触蛋白Vam3p的定位机制

基本信息

批准号：
07780616
负责人：
和田洋
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780616/
关键词：
液胞シンタクシン VAM3 PEP12

项目摘要

酵母の液胞膜に局在するシンタクシン関連蛋白質,Vam3pは構造上,同じく液胞へのタンパク輸送に機能するPep12pと高い相同性を有する.しかしながら,突然変異株の表現型は大きく異なる.まず,この点を明らかにするため,酵母のPEP12遺伝子をPCR法を用いて単離し,その遺伝子破壊株を作成し,その表現型の解析を行った.さらに,Pep12pの細胞内局在,タンパク質レベルでの解析を進めるため,抗Pep12p抗体を作成した.vam3変異株は多数の小胞様の構造を蓄積するが,pep12変異株は大きな液胞をもつ.また,vam3変異株は液胞タンパク質carboxypeptidase Yを細胞外に誤輸送せず,液胞膜タンパク質alkalinephosphataseの成熟化に欠損を示す.一方,pep12変異株はcarboxypaptidase Yを細胞外に誤輸送する一方,熟成型alkalinephosphataseをもつ.この対照的な表現型は,Vam3pとPep12pが似た分子であるが相互に異なる機能を担っていることを示している.そこで,pep12とvam3の二重突然変異をもつ酵母を作成し,その表現型を解析した.驚いたことには,この株は液胞と認められる構造体を持たなかった.さらに,液胞タンパク質の挙動を調べたところ,熟成型carboxypeptidase Y, alaklinephoshataseの両者を欠損しており,液胞コンパートメントを欠くことが形態的,生化学的に示唆された.このことは,これまで考えられていた液胞形成のモデルの修正をせまるものである.

Vam3p 是一种位于酵母液泡膜中的突触融合蛋白相关蛋白，与 Pep12p 具有高度的结构同源性，Pep12p 也在蛋白转运到液泡中发挥作用。然而，为了澄清这一点，我们分离了突变菌株的表型。使用 PCR 技术检测酵母 PEP12 基因，并创建了基因破坏的菌株。此外，为了进一步在蛋白质水平上分析Pep12p的细胞内定位，我们创建了抗Pep12p抗体。vam3突变株积累了大量的囊泡样结构，然而pep12突变株具有较大的液泡， vam3突变体有一个大液泡。 pep12突变菌株不会将Y误转运到细胞外，并且在液泡膜蛋白碱性磷酸酶的成熟方面表现出缺陷。虽然它将 Y 误转运到细胞外，但它具有成熟的碱性磷酸酶。这种对比表型表明 Vam3p 和 Pep12p 是相似的分子，但具有相互不同的功能。我们创建了一个具有液泡和 vam3 双重突变的酵母菌株，并分析了其表型，令人惊讶的是，该菌株不具有可被识别为液泡的结构。此外，我们还根据研究研究了成熟羧肽酶的行为。 Y和碱性磷酸酶，形态学和生化表明液泡室缺失。这表明之前认为的液泡形成模型需要修改。