液胞形態形成におけるVAM7遺伝子産物の機能

VAM7基因产物在液泡形态发生中的功能

基本信息

批准号：
05780523
负责人：
和田洋
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780523/
关键词：
液胞形成オルガネラ VAM7遺伝子液胞膜

项目摘要

液胞形態形成にはVAM7遺伝子の働きが必須であることが突然変異株を用いたこれまでの解析から示されている.VAM7遺伝子産物の機能とその細胞内局在を解析するために,まず,Vam7p特異的抗体の調製を行った.酵母VAM7遺伝子断片を大腸菌のbeta-ガラクトシダーゼのカルボキシル端に繋がったような融合タンパク質を発現するようなプラスミドを構築し、これを感染させた大腸菌をIPTG存在下に生育させ,菌体をフレンチプレスにより破砕したのち,ゲル濾過,DEAEを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーの手法によりlacZ-Vam7p融合タンパク質を精製した.また,グルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質を発現するようなプラスミドも同時に構築し,グルタチオンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりGST-Vam7p融合タンパク質を精製した.これらの融合タンパク質をもちいて,まず,lacZ-Vam7p融合タンパク質をウサギに免疫し,粗Vam7p抗血清を得た.この抗血清を,GST-Vam7pをカップルさせたカラムを通すことにより,Vam7pに対して高い特異性を持った抗体を調製することが出来た.この抗体を用いて酵母の細胞破砕液を免疫ブロットしたところ,37-kDaのタンパク質が認識された.また,この抗体によって37-kDのタンパク質が免疫沈降された.VAM7遺伝子の構造解析の結果,Vam7pの大きさは37-kDと予想されていたこと,また,VAM7遺伝子欠損株の細胞破砕液中にはこのタンパク質が見いだされなかったことからこの37-Kdのタンパク質がVam7pであると結論した.細胞分画法によって細胞内小器官を分画したところ,Vam7pは液胞膜上に存在することが示された.Vam7pはその構造上,きわめて親水性の高いタンパク質であるのにも関わらず,オルガネラ膜上に存在したことは他の膜タンパク質との相互作用することが考えられる.

先前使用突变菌株的分析表明，VAM7基因的功能对于液泡形态发生至关重要。为了分析VAM7基因产物的功能及其细胞内定位，我们首先，我们制备了Vam7p特异性抗体。构建表达融合蛋白的质粒，其中母体VAM7基因片段连接至大肠杆菌β-半乳糖苷酶的羧基端，并且感染了该质粒的大肠杆菌在IPTG存在下生长，并且细菌细胞受到法国媒体的关注。通过凝胶过滤和使用 DEAE 的离子交换柱层析纯化 lacZ-Vam7p 融合蛋白。我们同时构建了具有以下特性的质粒，并使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶通过亲和层析纯化了GST-Vam7p融合蛋白。用该融合蛋白免疫兔子以获得粗Vam7p抗血清。通过将该抗血清通过与GST-Vam7p偶联的柱，可以制备对Vam7p具有高特异性的抗体。使用该抗体。对酵母细胞裂解物进行免疫印迹时，识别出 37-kDa 的蛋白质。该抗体还免疫沉淀了 37-kD 的蛋白质。VAM7 基因的结构分析结果表明，Vam7p 的大小为 37-kD由于该蛋白质预计为 Vam7p，并且由于在 VAM7 基因缺陷菌株的细胞裂解物中未发现该蛋白质，因此当对细胞器进行分级时，我们得出结论，该 37-Kd 蛋白质是 Vam7p。大约在这个时候，Vam7p 被证明存在于液泡膜上，尽管 Vam7p 由于其结构而是一种高度亲水性的蛋白质，但它在细胞器膜上的存在表明它与其他膜蛋白不同，可以想象两者相互作用。