Analysis of molecular mechanisms underlying apoptosis resistance of hepatocellular carcinoma using proteomics

蛋白质组学分析肝细胞癌凋亡抵抗的分子机制

基本信息

批准号：
18390219
负责人：
SASAKI Yutaka
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

種々の癌治療により細胞内に導かれる酸化ストレスはアポトーシスを誘導するが、癌細胞は元来、アポトーシス抵抗性を特性として備えている。従って、その分子機構を解明することは癌治療成績を向上させるために不可欠である。これまでに、アポトーシス刺激下の遺伝子発現や蛋白質発現・機能の変化を、肝癌細胞株を用いて網羅的に解析し、アポトーシス抵抗性の責任分子を明らかしてきた。その中で、アポトーシス抵抗性の強い肝癌細胞株において、アポトーシス刺激後に、アポトーシスや細胞内情報伝達の関連遺伝子、転写因子の発現が亢進することを明らかにした。一方、蛋白質機能の制御に必要な燐酸化の解析では、細胞骨格や分子シャペロン関連蛋白質の燐酸化が有意に変動していた。以上の結果を統合したpathway解析で、アポトーシス刺激により転写や細胞接着に関連する分子群が誘導される事を明らかにした。さらに、HCV陽性ヒト肝癌組織と非癌部組織からcell lysateを調整し、2D-DIGEにて蛋白質発現ならびに翻訳後修飾の差異を検討した。最終的にはLC-MSショットガン法による質量分析から蛋白質を同定した。その結果、非癌部に比べて癌部で有意に燐酸化が上昇している約15個の燐酸化スポットより約35個の蛋白質を同定した。その中の多くが、細胞接着、分子シャペロン、細胞内情報伝達、レチノール酸代謝などの機能を有する蛋白質であった。また肝癌細胞株で得られた、アポトーシス抵抗性の候補責任分子群と対比を行ったところ、数種類の蛋白質については一致を認めた。現在、それらの分子について肝癌細胞株を用いて、siRNA、あるいは恒常的活性体を導入し、loss of function やgain of functionの手法により、候補責任分子の重要性を検証している。

各种癌症治疗引入细胞的氧化应激会诱导细胞凋亡，但癌细胞本质上抵抗细胞凋亡。因此，阐明其分子机制对于改善癌症治疗效果至关重要。迄今为止，我们已经利用肝癌细胞系全面分析了凋亡刺激下基因表达和蛋白表达/功能的变化，并阐明了负责凋亡抵抗的分子。其中，我们发现，在具有强凋亡抵抗的肝癌细胞系中，在凋亡刺激后，与凋亡和细胞内信号转导相关的基因和转录因子的表达增加。另一方面，对调节蛋白质功能所必需的磷酸化的分析揭示了细胞骨架和分子伴侣相关蛋白质的磷酸化的显着变化。整合上述结果的通路分析表明，细胞凋亡刺激诱导了一组与转录和细胞粘附相关的分子。此外，从HCV阳性人肝癌组织和非癌组织中制备细胞裂解物，并使用2D-DIGE检查蛋白质表达和翻译后修饰的差异。最终使用 LC-MS 鸟枪法通过质谱分析鉴定了该蛋白质。结果，从约 15 个磷酸化点中鉴定出约 35 种蛋白质，与非癌区域相比，癌区域的磷酸化显着增加。其中许多是具有细胞粘附、分子伴侣、细胞内信号转导和视黄酸代谢等功能的蛋白质。此外，当我们将结果与从肝癌细胞系中获得的一组负责细胞凋亡抵抗的候选分子进行比较时，我们发现与几种类型的蛋白质一致。目前，我们正在使用肝癌细胞系引入siRNA或这些分子的组成型活性形式，并使用功能丧失和功能获得技术来验证候选负责分子的重要性。