Minimization of thermostable water-splitting machinery of photosystem II by subunit gene replacement

通过亚基基因替换最小化光系统 II 的耐热水分解机制

• 批准号: 18560755
• 负责人: MATSUOKA Masayoshi
• 金额: $ 2.41万
• 依托单位: Sojo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18560755/
• 关键词: photosystem II; cyanobacteria; water splitting; D 1; D2 heterodimer; gene replacement; histidine tag; affinity chromatography; thermostability; rps12

A minimum unit required for photochemical water-splitting reaction is a heterodimer consisting of D1 and D2 proteins in reaction center of photosystem II (PSII). We investigated possible isolation of D 1/D2 heterodimer from mesophilic cyanobacterium, Synechococcus elongatus PCC 7942 expressing thermostable Dl/D2 proteins from a thermophile Thermosynechococcus vulcanus. To this end, we replaced ORFs of D1 and D2 genes in S elongatus with those from T vulcanus via rps12-mediated gene replacement method, a newly developed technology without limitation of the availability of drug-resistance markers. A C-terminal histidine tag was introduced into CP47 protein encoded by psbB gene to facilitate the purification of PSII complex. The resultant psbB mutant strain was heterogeneous for psbB gene, so that a psbT gene downstream the psbB gene was activated by inserting an extra copy of promoter upstream the psbT gene. In addition, a long stretch of DNA encompassing the psbB psbTregion was cloned to enhance the recombination frequency between plasmid and chromosome. Using psbB mutant strains thus created, Dl/D2 heterodimer was efficiently purified from PSII complex via Ni-affinity chromatography.

光化学解水反应所需的最小单位是光系统II（PSII）反应中心由D1和D2蛋白组成的异二聚体。我们研究了从嗜温蓝藻、细长聚球藻 PCC 7942 中分离 D 1/D2 异二聚体的可能性，所述蓝藻表达来自嗜热热聚球藻的热稳定性 D1/D2 蛋白。为此，我们通过rps12介导的基因替换方法，将S elongatus中D1和D2基因的ORF替换为T vulcanus中的ORF，这是一种新开发的技术，不受耐药标记的可用性的限制。将C端组氨酸标签引入psbB基因编码的CP47蛋白中以促进PSII复合物的纯化。所得的psbB突变株对于psbB基因是异质的，因此通过在psbT基因上游插入额外的启动子拷贝来激活psbB基因下游的psbT基因。此外，还克隆了一段包含 psbB psbT 区域的长 DNA 片段，以增强质粒和染色体之间的重组频率。使用由此产生的psbB突变株，通过Ni亲和层析从PSII复合物中有效地纯化D1/D2异二聚体。

项目成果

シアノバクテリアの光化学系豆のアフィニティー精製

蓝藻光化学豆的亲和纯化

• 发表时间: 2007
• 作者: Kaseda;J.;et. al.;加世田 淳;加世田 淳
• 通讯作者: 加世田 淳

Affinity purification of cyanobacterial photosystem II.

蓝藻光系统的亲和纯化II。

• 发表时间: 2008
• 作者: Kaseda;J.;et. al.
• 通讯作者: et. al.

シアノバクテリアの光化学系IIのアフィニティー精製

蓝藻光系统II的亲和纯化

• 发表时间: 2007
• 作者: Kaseda;J.;et. al.;加世田 淳;加世田 淳;加世田 淳
• 通讯作者: 加世田 淳

Characterization of cyanobacterial mutant strains carrying histidine tag at CP47 in photosystem II.

光系统 II 中 CP47 处携带组氨酸标签的蓝藻突变菌株的表征。

• 发表时间: 2008
• 作者: Kaseda;J.;et. al.
• 通讯作者: et. al.

光化学系II CP47ヘヒスチジンタグを付加したシアノバクテリア変異株の特性解析

带有光系统 II CP47-hehistidine 标签的蓝藻突变体的表征

• 发表时间: 2007
• 作者: Kaseda;J.;et. al.;加世田 淳
• 通讯作者: 加世田 淳