窒素源濃度制御による遺伝子組換え枯草菌から有用物質の効率的生産

通过控制氮源浓度从转基因枯草芽孢杆菌中高效生产有用物质

基本信息

批准号：
06750824
负责人：
朴龍洙
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Shizuoka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、工業的に重要な遺伝子組換え枯草菌を用いて、窒素源濃度制御を行うことによる有用遺伝子産物の効率的な生産を目的とし、次のような研究成果を得ている。1.本研究で用いた遺伝子組換え枯草菌の主なエネルギー源は、窒素源である。従って、窒素源による菌体内脱アミノ反応の結果、培養液中にアンモニアを蓄積することが分かった。培養初期アンモニア濃度の影響を調べた結果、アンモニア濃度1g/Lを培地に添加した場合、無添加に比べて菌体増殖速度と遺伝子発現はそれぞれ2倍と10倍まで減少した。2.培養中に蓄積されるアンモニア濃度を制御するために窒素源濃度のオンライン測定システムを開発した。倍地中の窒素源は主にアミノ酸であることでアミノオキシダーゼを固定した酸素センサーを利用し、窒素源濃度をオンラインで計測することができた。さらに、この装置に窒素源濃度を制御するためのソフトウエアを組み込み、窒素源濃度をオンラインで測定・制御することができた。3.本研究で開発したオンライン窒素源測定・制御装置を用いてアミノ酸濃度を20、10、5及び2mMに制御した。培養中、アミノ酸濃度を低レベルに制御するに従って蓄積されるアンモニア濃度は減少し、比遺伝子産物生産速度及び窒素源からの収率は増加した。4.遺伝子発現を増大するために遺伝子発現レベルに対する20種類のアミノ酸の影響について調べた。その中でイソロイシンとアスパラギンを添加した場合、無添加に比べ、遺伝子発現は2倍以上向上した。従って、イソロイシンとアスパラギンを富化した窒素源を用い、窒素源を低レベルに制御することによって今までの遺伝子発現を2倍以上向上させた。

本研究旨在利用工业上重要的转基因枯草芽孢杆菌，通过控制氮源浓度来高效生产有用的基因产物，并获得了以下研究成果。 1.本研究使用的转基因枯草芽孢杆菌的主要能量来源是氮源。因此，发现由于氮源引起的细胞内脱氨基反应，培养液中积累了氨。研究培养初期氨浓度的影响，结果发现，当培养基中添加1 g/L氨浓度时，细菌生长速度和基因表达量分别比对照组下降2倍和10倍。至不添加氨时。 2.我们开发了氮源浓度在线测量系统，以控制培养过程中积累的氨浓度。由于培养基中的氮源主要是氨基酸，因此我们能够使用带有固定化氨基氧化酶的氧传感器在线测量氮源浓度。此外，该装置还集成了氮源浓度控制软件，可以实现氮源浓度的在线测量和控制。 3.利用本研究开发的在线氮源测控装置将氨基酸浓度控制在20、10、5和2mM。培养过程中，随着氨基酸浓度控制在较低水平，积累的氨浓度降低，氮源中特定基因产物的产率和产量增加。 4.为了增加基因表达，我们研究了20种氨基酸对基因表达水平的影响。其中，当添加异亮氨酸和天冬酰胺时，基因表达量比不添加时增加了一倍多。因此，通过使用富含异亮氨酸和天冬酰胺的氮源并将氮源控制在较低水平，基因表达量比以前提高了一倍以上。