インスリンによるGLUT4のtranslocationにおけるMAPキナーゼの機能の解析

MAP激酶在胰岛素诱导的GLUT4易位中的功能分析

基本信息

批准号：
06770806
负责人：
井上元
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770806/
关键词：
インスリン 3T3-L1脂肪細胞 MAPキナーゼ糖輸送担体低分子量GTP結合蛋白

项目摘要

本研究はGLUT4-containing vesiclesに存在するMAP kinaseの基質を同定し、それらのインスリンによるGLUT4のtrans locationで果たす役割及びその調節機構を解明することを目的とした。特に、exocytosisに関与するとされる低分子量GTP結合蛋白、Rab3Dの、MAP KinaseやGLUT4-containing vesiclesとの関係について検討した。3T3-L1脂肪細胞では、抗Rab3D抗体によるimmunoblottingにて25及び28kDaの蛋白を特異的に認識した。細胞膜分画では28kDaの、細胞内膜分画では25及び28kDaの、細胞質では25kDaの蛋白が検出されたが、どの分画でもインスリンによる量の変化は検出されなかった。GLUT4-containing vesiclesではRab3Dは検出できなかった。この抗体はGTP結合能を持つ28kDaの蛋白を免疫沈降するが、この蛋白はin vitroでMAP kinaseにより酸化された。しかし、^<32>P正リン酸で細胞ラベルして行った検討では、インスリン非刺激でもRab3Dはリン酸化されており、シンスリンによるリン酸化状態の変化は検出できず、さらに、3T3-L1脂肪細胞をインスリン処理して脱リン酸化を阻害する条件で抗Rab3D抗体による免疫沈降を行い、in vitroでMAP kinaseによる免疫沈降物のリン酸化を検討したが、28kDaの蛋白のMAP Kinaseによるリン酸化の程度には差異は見られなかった。以上より、1、インスリンによりその局在は変化しない。2、Rab3Dは、細胞内peoolのGLUT4-containing vesicleには少なくとも強固には会合しない。3、Rab3Dは、in vitroではMAP kinaseの基質となるが、in vivoではインスリンによりそのリン酸化状態は大きくは変化しない、と考えられた。現在、構成的活性化を受けたMAP kinase kinaseをレトロウィルスベクターを用いて3T3-L1脂肪細胞に導入し、糖輸送におけるMAP kinaseの役割を検討中である。

本研究的目的是鉴定含有 GLUT4 的囊泡中存在的 MAP 激酶底物，并阐明它们在胰岛素转运 GLUT4 中的作用及其调节机制。特别是，我们研究了 Rab3D（一种被认为参与胞吐作用的低分子量 GTP 结合蛋白）与 MAP 激酶和含有 GLUT4 的囊泡之间的关系。在 3T3-L1 脂肪细胞中，使用抗 Rab3D 抗体进行免疫印迹可特异性识别 25 和 28kDa 蛋白质。在细胞膜级分中检测到28kDa的蛋白质，在细胞内膜级分中检测到25kDa和28kDa的蛋白质，在细胞质中检测到25kDa的蛋白质，但在任何级分中均未检测到由胰岛素引起的量变化。在含有 GLUT4 的囊泡中无法检测到 Rab3D。该抗体可免疫沉淀具有 GTP 结合能力的 28kDa 蛋白，该蛋白在体外被 MAP 激酶氧化。然而，在用^ 32 P正磷酸盐标记细胞进行的研究中，即使没有胰岛素刺激，Rab3D也被磷酸化，并且不能检测到合成尿素引起的磷酸化状态的变化，我们在以下条件下用抗Rab3D抗体进行了免疫沉淀。通过用胰岛素处理细胞来抑制去磷酸化，并在体外通过 MAP 激酶检测免疫沉淀物的磷酸化。激酶磷酸化程度没有观察到差异。由上可知，1.胰岛素的定位没有改变。 2. Rab3D 与细胞内含有 GLUT4 的囊泡没有很强的相关性。 3. Rab3D在体外是MAP激酶的底物，但在体内其磷酸化状态不会因胰岛素而发生明显改变。我们目前正在使用逆转录病毒载体将组成型激活的 MAP 激酶激酶引入 3T3-L1 脂肪细胞，并正在研究 MAP 激酶在糖转运中的作用。