RNAiランダムスクリーニング方を用いたp53誘導新規アポトーシス関連因子の検索

利用RNAi随机筛选方法寻找新的p53诱导凋亡相关因子

• 批准号: 17790950
• 负责人: 羽田 裕司
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790950/
• 关键词: RNAi; p53; アポトーシス; ランダムスクリーニング

1.p53誘導性アポトーシス・スクリーニングシステムの確立Clontec社tet-onシステムを用いて、内在性p53の欠失したsaos2細胞株にテトラサイクリン(tet)の濃度依存的にp53を過剰発現する細胞(saos2/tet-on-p53)を作成。この細胞はドキシサイクリン(tetアナログ)の添加によりその濃度依存的にp53の過剰発現が誘導、アポトーシスとなる。しかし本研究でのスクリーニングにはtetによる誘導後に生存する細胞はすべて偽陽性として拾われてしまうため、全ての細胞死が誘導されるラインを選別中である。2.レトロウイルスshRNA発現システムの確立RNAiは2本鎖RNA (dsRNA)を細胞内に導入することでそのRNA配列に特異的な発現抑制がかかる手法で、哺乳類細胞へは21ヌクレオチド前後の短いdsRNAを形質導入することで標的遺伝子の発現を抑制できる。近年ではdsRNAの代わりに、プラスミドベクターを用いて2つの相補的配列をとる21ヌクレオチドの配列の間に短い配列をはさんだ1本鎖のRNAを転写させ細胞内で、dsRNAと同様の効果を安定して発揮するベクターが開発されており、本研究ではClontec社のpSIREN-RetroQ vectorを用いた。ランダムライブラリー作成の準備段階として、関連因子として解析が進んでいるBax, Puma, Noxa等に対するベクターをpositive controlとして作成、1,のsaos2/tet-on-p53細胞に導入し、アポトーシス抑制能の解析を試みた。3、ランダムshRNAライブラリーの作成本研究で作成を目指したランダムshRNAライブラリーは21ヌクレオチドをランダムに作成するため理論上4^<21>=4×10^<12>のスクリーニングが可能であるが、まず一次スクリーニングのため少数のライブラリーの作成に取りかかった。

1.p53诱导凋亡筛选体系的建立利用Clontec的tet-on系统，细胞过表达p53（saos2/Created tet-on-p53）。添加强力霉素（tet 类似物）会以浓度依赖性方式诱导 p53 过度表达，导致这些细胞凋亡。然而，在本研究的筛选中，用 tet 诱导后存活的所有细胞都被视为假阳性，因此我们目前正在选择诱导所有细胞死亡的细胞系。 2.逆转录病毒shRNA表达系统的建立RNAi是通过将双链RNA(dsRNA)导入细胞内来抑制特定RNA序列的表达的方法，通过转导目的基因可以抑制目的基因的表达。近年来，质粒载体取代了dsRNA，用于转录夹在两个具有互补序列的21个核苷酸序列之间的短序列的单链RNA，在细胞中稳定地产生与dsRNA相同的效果。表现出这种效果，在本研究中，使用了 Clontec 的 pSIREN-RetroQ 载体。作为随机文库创建的准备步骤，创建了目前正在作为相关因素进行分析的 Bax、Puma、Noxa 等载体作为阳性对照，并将其引入到 1 中所述的 saos2/tet-on-p53 细胞中。为了确定它们抑制细胞凋亡的能力，我尝试对其进行分析。 3. 随机shRNA文库的创建 我们本研究旨在创建的随机shRNA文库随机创建21个核苷酸，因此理论上可以筛选4^<21>=4×10^<12> ，我们从创建开始。少量文库进行初步筛选。