組換え蛍光標識法による天疱瘡抗原のバイオイメージング法の開発

重组荧光标记法开发天疱疮抗原生物成像方法

• 批准号: 17790782
• 负责人: 藤本 篤嗣
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790782/
• 关键词: デスモソーム; デスモグレイン; ケラチン; カドヘリン; 中間径線維; 細胞間接着; 天疱瘡; 蛍光蛋白質

本年度は、表皮角化細胞間接着に重要なデスモソームの構成蛋白であるデスモグレイン(Dsg)3、ならびにデスモソームを裏打ちする中間径線維の一つであるケラチン14(K14)に、それぞれ蛍光蛋白質を融合した発現ベクターを複数作成した。そして作成した発現ベクターを培養角化細胞株に遺伝子導入して、発現蛋白の細胞内における局在を観察した。角化細胞に対する遺伝子導入効率に優れたK5プロモータの下流に、マウスDsg3全長およびGFPのcDNAをタンデムに挿入した発現ベクターを作成した。作成した発現ベクターをPam212培養マウス角化細胞株に遺伝子導入したところ、Dsg3-GFP融合蛋白が角化細胞同士の接着面において点状に発現する像が認められた。またK5プロモータの下流に、DsRedおよびhuman K14のcDNAを挿入した発現ベクターを作成してPam212細胞に遺伝子導入したところ、DsRed-hK14融合蛋白が細胞質において網状の構築を示した。さらにDsg3-GFPおよびDsRed-hK14の発現ベクターをPam212細胞にco-transfectionしたところ、同一細胞において膜表面に発現したDsg3-GFPが、DsRed-hK14により裏打ちされる像が観察された。以上の結果より、今回作成したcDNAは、培養生細胞におけるデスモソーム関連蛋白の細胞内局在の経時的変化を解析する上で有用なツールとなると考えられた。今後は作成したcDNAを用いて、アデノウイルス発現系を用いた蛍光融合蛋白の培養角化細胞における発現解析、ならびにmDsg3-GFPならびにDsRed-hK14を表皮基底細胞に発現したdouble transgenic mouseの作成を試みる予定である。

今年，我们将荧光蛋白与桥粒糖蛋白 (Dsg)3 和角蛋白 14 (K14) 融合，桥粒糖蛋白 (Dsg)3 是桥粒的组成蛋白，对表皮角质形成细胞之间的粘附很重要，而角蛋白 14 (K14) 是桥粒内衬的中间纤维之一。然后，将所创建的表达载体导入培养的角质形成细胞系，并观察表达蛋白的细胞内定位。我们创建了一个表达载体，其中将全长小鼠 Dsg3 和 GFP cDNA 串联插入 K5 启动子下游，该表达载体在角质形成细胞中具有出色的基因转移效率。当将所创建的表达载体导入Pam212培养的小鼠角质形成细胞系时，观察到Dsg3-GFP融合蛋白在角质形成细胞之间的粘附表面以点状方式表达。此外，当我们创建将 DsRed 和人 K14 cDNA 插入 K5 启动子下游的表达载体并将基因导入 Pam212 细胞时，DsRed-hK14 融合蛋白在细胞质中显示出网状结构。此外，当我们用 Dsg3-GFP 和 DsRed-hK14 的表达载体共转染 Pam212 细胞时，我们观察到在相同细胞膜表面上表达的 Dsg3-GFP 受到 DsRed-hK14 的支持。基于上述结果，本次创建的cDNA被认为是分析培养活细胞中桥粒相关蛋白的细胞内定位随时间变化的有用工具。未来，我们将利用所创建的cDNA，利用腺病毒表达系统分析培养的角质形成细胞中荧光融合蛋白的表达，并计划创建在表皮基底细胞中表达mDsg3-GFP和DsRed-hK14的双转基因小鼠。 。