膜マイクロドメインでの脂質・蛋白質間相互作用によるG蛋白質シグナルの生理的制御

膜微区中脂蛋白相互作用对 G 蛋白信号的生理调节

基本信息

批准号：
17790170
负责人：
石井優
金额：
$ 2.24万
依托单位：
National Hospital Organization Osaka-Minami Medical Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本申請研究では、膜蛋白質機能(特にG蛋白質シグナル伝達機構)の生理的調節に、脂質マイクロドメインがどのような役割を果たしているかを、統合的かつ実体的に解析することを目的としている。特に平成17年度は、下記の点について解明を行った。1.G蛋白質サイクルの生理的制御因子であるRegulators of G protein signaling(RGS)蛋白質が、脂質マイクロドメインに存在するPhosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate(PIP_3)とカルシウム/カルモデュリン(CaM)によって相互的に制御されており、この制御がRGS蛋白質の生理的機能発現に必須であることを示した。詳細な解析によりPIP_3とCaMは化学量論的解析により競合的であることを明らかとし、さらに構造生物学的アプローチにより、この制御機構は、RGS蛋白質上の正電荷クラスターをもつα5ヘリックス上で行われていることを解明した(Ishii et al.,Biochem.J.,2005)。2.上記1.のRGS蛋白質の制御機構に実際に脂質マイクロドメイン(脂質ラフト)が関与していることをFluorescent Resonance Energy Transfer(FRET)によるイメージング法を用いて証明した。Yellow Fluorescent ProteinでラベルしたRGS蛋白質とCyan Fluorescent ProteinでラベルしたCaM間では、カルシウム依存性のFRETシグナルの増強が見られるが、脂質マイクロドメインを破壊する操作を加えたり、RGS蛋白質に脂質マイクロドメインへの局在に必須のアミノ酸に変異を加えたものでは、FRETシグナルの増強が見られなかった。これはRGS蛋白質の生理的制御機構に脂質マイクロドメインへの局在が重要であると示す結果である(Ishii et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2005)。3.さらに、RGS蛋白質や、それによって制御されるG蛋白質サブユニット、効果器である神経型カルシウムチャネルなどが、G蛋白質の活性化に伴って脂質マイクロドメイン間を移動することを証明した(Ishii et al.,submitted)。神経型カルシウムチャネルはG蛋白質シグナル(G蛋白質αoサブユニット)によって抑制を受けることが知られていたが、本研究でG蛋白質αoサブユニットがG蛋白質受容体刺激により、脂質ラフトから非ラフト部分へと、脂質マイクロドメイン間を移動することが明らかになった。一方効果器であるカルシウムチャネルは常に非ラフト部分に存在していた。これは、G蛋白質αoサブユニットが刺激により、効果器が存在するマイクロドメインに移動するという新しい制御機構が存在することを意味する結果である。

本研究的目的是全面、实质性地分析脂质微结构域在膜蛋白功能（特别是G蛋白信号转导机制）的生理调节中的作用。 2005年，我们特别明确了以下几点。 1.G 蛋白信号传导 (RGS) 蛋白的调节剂是 G 蛋白循环的生理调节剂，通过存在的磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 (PIP_3) 和钙/钙调蛋白 (CaM) 相互作用我们发现这种调节对于 RGS 蛋白的生理功能的表达至关重要。详细分析表明，基于化学计量分析，PIP_3 和 CaM 是竞争性的，结构生物学方法表明，这种调节机制是在 RGS 蛋白上带有正电荷簇的 α5 螺旋上进行的（Ishii 等，Biochem. J）。 .，2005）。 2. 利用荧光共振能量转移（FRET）成像方法，我们证明了脂质微结构域（脂筏）实际上参与了上述1中提到的RGS蛋白的调节机制。在黄色荧光蛋白标记的 RGS 蛋白和青色荧光蛋白标记的 CaM 之间观察到钙依赖性 FRET 信号增强，当向定位必需的氨基酸添加突变时，未观察到 FRET 信号增强。该结果表明脂质微结构域的定位对于 RGS 蛋白的生理控制机制很重要（Ishii 等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2005）。 3. 此外，我们还证明了 RGS 蛋白、由其控制的 G 蛋白亚基以及作为效应器的神经元钙通道，与 G 蛋白激活一起在脂质微结构域之间移动（Ishii 等人提交）。已知神经元钙通道会受到G蛋白信号（G蛋白αo亚基）的抑制，但在这项研究中，G蛋白αo亚基通过G蛋白受体刺激从脂筏转移到非脂筏区域。在脂质微结构域之间移动。另一方面，作为效应器的钙通道始终存在于非筏区域。这一结果表明存在一种新的控制机制，其中G蛋白αo亚基在受到刺激时移动到效应子所在的微结构域。