Importinαの核内における新たな機能の探索と細胞核ストレス応答

寻找importinα在细胞核和核应激反应中的新功能

基本信息

批准号：
17770161
负责人：
宮本洋一
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17770161/
关键词：
核輸送細胞核ストレス応答 Importin α

项目摘要

本研究課題は、紫外線照射などのストレスに応じて、通常、細胞質に多く局在する核移行シグナル(Nuclear Localization Signal : NLS)受容体分子importin αが、すみやかに(数分以内に)核集積することを発見したことに端を発する。Importin αはNLSと輸送担体importin βとをつなぐアダプター分子として理解され、NLSを核へ輸送した後は、核内に存在するCAS(exportin 2)と低分子量Gタンパク質Ranとの複合体の形で細胞質に戻されることが分かっている。我々は、主に核に存在するRanがストレスに応じて細胞質に遊出し、結果として核内におけるimportin α/CAS/Ranによる3者複合体の形成効率が低下することでimportin αの核内集積を誘導すうことを明らかにしてきた。さらに最近、我々はこのRanの細胞質遊出が、ストレスによる細胞内ATP量の減少が引き金となって起こることを見出した(Yasuda et al., Exp.Cell Res.,2005)。一旦、核に集積したimportin αは、Ranを過剰に供給しても細胞質に移行せず核に留まる。さらに、核内蓄積したimportin αは、DNaseI処理により遊離してくる(未発表)。これらのことは、ストレス応答的に核内に集積したimportin αがクロマチン様構造体と結合し、ゲノムの修復や機能維持、さらにはストレス応答時の転写調節などクロマチン機能に関わっていることを示唆している。そこで、本研究では、importin αが、ストレスに応じて核内に大量に移行したこと自体が、核内分子との結合を誘発し、機能の発現を導いていると想定して研究を開始した。まず、CASとの結合領域に変異をいれた点変異体を作製し、培養細胞に導入してimportin αを強制的に核内にとどめるシステムを構築した。この細胞よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを用いて変動する遺伝子を網羅的に探索した結果、発現が2倍以上増加する遺伝子が2種類に対して、減少する遺伝子が60種以上も存在していた。このことは、強制的に核に局在させたimportin αが、転写抑制機構に関与している可能性を示唆している。特に興味深いことに、H2A,H2Bなどヒストンの転写量が顕著に低下していた。今後は、importin αの核内集積がヒストンの転写量減少にどのように関与しているか、そのメカニズムを明らかにしていくことで細胞核におけるストレス応答の分子機構を解明していく。

这项研究的目的是，为了应对紫外线照射等应激，通常大量定位于细胞质中的核定位信号（NLS）受体分子输入α会迅速（几分钟内）在细胞核中积累当我发现这一点时，一切就开始了。 importin α被理解为连接NLS和转运载体importin β的衔接分子，将NLS转运到细胞核后，与细胞核中存在的CAS（exportin 2）和低分子量的复合物形式进行转运已知G蛋白Ran返回细胞质。我们发现主要存在于细胞核中的Ran在应激时迁移到细胞质中，导致细胞核内形成输入蛋白α/CAS/Ran三元复合物的效率降低，导致Ran的积累已经明确它会诱导细胞核中的输入蛋白α。此外，我们最近发现，这种 Ran 的细胞质外渗是由应激引起的细胞内 ATP 量减少引发的（Yasuda 等人，Exp.Cell Res.，2005）。一旦在细胞核中积累，即使 Ran 供应过量，输入蛋白 α 也不会迁移到细胞质并保留在细胞核中。此外，通过 DNaseI 处理（未发表）释放细胞核中积累的输入蛋白 α。这些发现表明，在应激反应中在细胞核中积累的输入蛋白α与染色质样结构结合，并参与染色质功能，例如基因组修复和功能维护，以及应激反应期间的转录调节。。因此，在本研究中，我们的研究假设是，大量的输入蛋白α因应激而转移到细胞核中，本身会诱导与细胞核分子的结合，从而导致其功能的表达。首先，我们创建了一个 CAS 结合区发生突变的点突变体，并将其引入培养细胞中，以创建一个强制输入 α 保留在细胞核中的系统。从这些细胞中提取RNA，并利用DNA微阵列全面寻找波动的基因，结果发现，虽然有两个基因的表达量增加了一倍以上，但有超过60个基因的表达量下降了。这表明被迫定位于细胞核的输入蛋白α可能参与转录抑制机制。特别有趣的是，H2A 和 H2B 等组蛋白的转录水平显着降低。未来，我们将通过阐明importin α的核积累如何参与组蛋白转录水平的降低及其背后的机制，阐明细胞核应激反应的分子机制。